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Summary

Un metodo accurato per la valutazione della morte cellulare è descritto. Il protocollo migliora convenzionale annessina V / propidio ioduro (PI), i protocolli, che mostra fino al 40% di falsi positivi eventi in linee cellulari e cellule primarie da una vasta gamma di modelli animali.

Abstract

Studi di apoptosi cellulare sono stati significativamente influenzati dall'introduzione della citometria a flusso basato su metodi. Ioduro di propidio (PI) è ampiamente utilizzato in combinazione con annessina V per determinare se le cellule sono vitali, apoptotiche o necrotiche attraverso differenze di integrità della membrana plasmatica e ^1,2 permeabilità. Il V / PI annessina protocollo è un metodo comunemente usato per lo studio delle cellule apoptotiche ^3. PI è usato più spesso di altre macchie nucleare perché è economica, stabile e un buon indicatore della vitalità cellulare, basato sulla sua capacità di escludere la tintura in cellule viventi ^4,5. La capacità di PI di inserire una cella dipende dalla permeabilità della membrana; PI non macchia cellule apoptotiche dal vivo o inizio a causa della presenza di una membrana plasmatica intatto ^1,2,6. Alla fine di cellule apoptotiche e necrotiche, l'integrità delle membrane plasmatiche e nucleari diminuisce ^7,8, permettendo PI di passare attraverso le membrane, intercalate in acidi nucleici, e visualizzare fluorescenza rossa ^1,2,9. Purtroppo, ci accorgiamo che convenzionale annessina V / PI protocolli di portare ad un significativo numero di falsi eventi positivi (fino al 40%), che sono associati con colorazione PI di RNA all'interno del compartimento citoplasmatico ^10. Cellule primarie e linee cellulari in una vasta gamma di modelli animali sono colpiti, con celle di grandi dimensioni (nucleare: i rapporti citoplasmatica <0,5) che mostra la più alta presenza ^10. Qui, si dimostra una versione modificata annessina V / PI metodo che fornisce un significativo miglioramento per la valutazione della morte cellulare rispetto ai metodi tradizionali. Questo protocollo si avvale delle variazioni di permeabilità cellulare durante la divisione cellulare di fissaggio per promuovere ingresso di RNase A nelle cellule dopo la colorazione. Sia i tempi e la concentrazione di RNase A sono state ottimizzate per la rimozione di RNA citoplasmatici. Il risultato è un miglioramento significativo rispetto ai tradizionali annessina V / PI protocolli (<5% di eventi con colorazione citoplasmatica PI).

Protocol

Questa procedura può essere eseguita in 500 microlitri tubi siliconato o 6 ml in polistirolo a fondo rotondo tubi FACS. Quest'ultimo è normalmente utilizzati nello svolgimento di analisi di fattibilità in collaborazione con altre procedure. Tutti i volumi indicati sono per 6 ml di polistirolo a fondo rotondo tubi FACS. Per 500 microlitri tubi di silicone e ridurre tutti i volumi da 1 / 5. La concentrazione ottimale per l'analisi di citometria a flusso è di 2-4 x 10 6 cellule per volume di 200 microlitri. Perdita di cellule possono derivare da questa procedura, e quindi si consiglia di ogni campione è composto da 4 x 10 6 cellule all'inizio della procedura. 1. Preparazione delle cellule Celle di raccolta – si riferiscono a procedure specifiche per le linee di cellule corrispondente o isolamenti cellula primaria. Centrifugare i campioni a 335 x g per 10 minuti e decantare il surnatante. Risospendere le cellule in 2 ml 1 x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) – / – (senza calcio, senza magnesio). Centrifugare i campioni a 335 x g per 10 minuti e decantare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 ml di buffer di 1 x annessina V vincolanti. Centrifugare i campioni a 335 x g per 10 minuti e decantare il surnatante. Risospendere le cellule in 100 ul buffer di 1 x annessina V vincolanti. 2. Applicazione di annessina V / PI Stain Aggiungi annessina V in base alle raccomandazioni del fabbricante [ad esempio 5 microlitri annessina V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)]. Incubare le provette al buio per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 100 ml di buffer di 1 x annessina V vincolante per ciascun tubo di reazione. Ci dovrebbe essere di circa 200 l in ciascun tubo. Aggiungere 4 ml di PI (Sigma, Cat # P-4864-10ML) che è stato diluito 1:10 in 1 tampone x annessina V vincolante (cioè 1 PI microlitri con 9 microlitri buffer di 1 x annessina V vincolante). Questo produrrà una concentrazione finale PI di 2 mg / ml in ciascun campione. Incubare le provette al buio per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 500 microlitri di buffer 1 x annessina V vincolante per lavare le cellule. Centrifugare i campioni a 335 x g per 10 minuti e decantare il surnatante. Risospendere le cellule in 500 microlitri buffer di 1 x annessina V vincolante e 500 microlitri di formaldeide al 2% per creare una soluzione all'1% di formaldeide (fissativo). Mescolare tubi da sfogliando gentile. Fissare i campioni in ghiaccio per 10 minuti. In alternativa, i campioni possono essere conservati notte a 4 ° C al buio. Se il metodo di quest'ultimo è scelto, assicuratevi di essere coerente in tutti i tubi etichettati con annessina V / PI (compresi i controlli di compensazione). Aggiungere 1 ml 1 x PBS – / – per ogni campione e miscelare delicatamente sfogliando. Centrifugare i tubi a 425 x g per otto minuti e decantare il surnatante. Ripetere i passaggi 2.10 e 2.11. Risospendere le sfere muovendo il tubo. Aggiungere 16 ml di diluito 1:100 RNAsi A (Sigma, R4642) per ottenere una concentrazione finale di 50 mg / ml. Incubare per 15 minuti a 37 ° C. Aggiungere 1 ml 1 x PBS – / – e mescolare delicatamente dal sfogliando. Centrifugare i tubi a 425 x g per otto minuti. I campioni sono ora pronti per essere analizzati. In alternativa, i campioni possono essere utilizzati per la colorazione passi successivi se annessina / PI colorazione viene eseguita in parallelo con altre procedure. 3. Rappresentante dei risultati: Esempi di tipi di cellule e linee cellulari che presentano diversi gradi di falsi positivi colorazione PI sono mostrati in Figura 1. Per spiegare il falso-positivi gli eventi, le cellule sono state fissate e poi trattati con RNasi A. Questo si traduce in una diminuzione significativa del numero di falsi positivi eventi, rispetto alle cellule che non siano sottoposti a trattamento RNasi (Figura 2B). Figura 2C mostra immagini rappresentative di cellule che sottoposti a trattamento RNAsi, rispetto alle cellule che non ha avuto un trattamento RNAsi. La Figura 3 mostra come la modifica annessina V / PI protocollo, con la fissazione e fasi di trattamento RNase, migliora protocolli convenzionali, limitando il numero di falsi positivi eventi di colorazione. Figura 1. Protocolli di colorazione convenzionale propidio ioduro di portare ad un significativo numero di falsi eventi positivi. Abbiamo già valutato estensione della colorazione falsa positiva attraverso le cellule primarie attraverso una vasta gamma di modelli animali e in una varietà di linee cellulari 10. Immagini rappresentative mostrano estensione della colorazione falsa positiva in tre popolazioni di cellule unico (una linea cellulare di uso comune – macrofagi RAW e due cellule primarie – murino macrofagi del midollo osseo (BMM) e macrofagi reni pesci rossi primaria (PKM)). La vera eventi positivi visualizzare l'atteso co-localizzazione tra PI e DRAQ5 all'interno del compartimento nucleare (aree giallo raffigurano colocalizzazione tra PI e DRAQ5). DRAQ5 è altamente membranene permeabile colorante che con precisione le macchie vano nucleare in cellule vive e morte 10,11,12. Per facilitare la determinazione visiva della colocalizzazione DRAQ5 macchia è stata data una pseudocolour verde. Figura 2. Migliorare l'accuratezza della colorazione PI nucleare. (A) hanno valutato l'accuratezza della colorazione PI nucleare basato sul grado di similarità di una serie di ben caratterizzato macchie nucleare (BrdU, 7-AAD e DAPI) per DRAQ5. BrdU è un nucleoside sintetico che viene incorporato nel DNA delle cellule proliferanti, e come tale sarà unica macchia all'interno del compartimento nucleare. 7-AAD ha un'alta affinità per il DNA e, simile a PI, non può attraversare una membrana plasmatica intatto. DAPI ha anche una forte affinità per il DNA nucleare ed è il più comunemente usato macchia nella microscopia a fluorescenza. Il grado di somiglianza era> 99% tra BrdU, 7-AAD, DAPI e DRAQ5, evidenziando la loro capacità di macchiare con precisione il nucleo della cellula in macrofagi RAW 264.7. Al contrario, la colorazione citoplasmatica PI sulla base di protocolli convenzionali porta ad una diminuzione marcata somiglianza per cento della colorazione rispetto al DRAQ5. (B) Risultati simili sono stati osservati in due cellule primarie testate: murino macrofagi del midollo osseo (BMM) e macrofagi reni pesci rossi primaria (PKM). L'incorporazione di 50 mg / ml RNasi A in fase di specifici all'interno della procedura di colorazione rimuove non nucleari colorazione PI e aumenta in modo significativo il grado di somiglianza rispetto alla DRAQ5 colorazione. (C) immagini Rappresentante dei macrofagi renali primari mostrano il grado di somiglianza per celle con e senza trattamento RNAsi. Per facilitare la determinazione visiva delle differenze tra i trattamenti, DRAQ5 è stata data una verde. Aree giallo raffigurano colocalizzazione tra BrdU e DRAQ5 e PI e DRAQ5. Figura 3. Modificato annessina V / PI riduce significativamente l'apoptosi false / eventi necrotico. Macrofagi primari reni pesci rossi (PKM) sono state colorate con convenzionali e modificato annessina V / PI protocolli. Scatterplot raffigurano l'annessina V / PI macchia in PKM pesci rossi. La dispersione a sinistra mostra convenzionale annessina V / PI colorazione (non RNasi) di cellule PKM. La dispersione a destra mostra PKM cellule colorate con il annessina V modificato / PI protocollo (con RNasi). L'aggiunta di risultati RNase in una marcata riduzione della colorazione PI a causa della rimozione di macchie di falsi positivi. PKM cellule sono state poi analizzate in base a distinte popolazioni all'interno delle culture e l'inizio progenitori (PE), monociti (Mono) e macrofagi maturi (Mat mac). La riduzione del numero di eventi PI positivo, dovuto alla rimozione del falso eventi positivi è più pronunciata nelle grandi cellule macrofagi maturi che in piccole cellule progenitrici presto. Conclusioni basate su protocolli convenzionali avrebbe erroneamente suggerito una correlazione positiva con la morte cellulare per i sottoinsiemi dei macrofagi più maturi.

Discussion

L'annessina V / PI protocollo qui presentato è una versione modificata di protocolli convenzionali e tiene conto della presenza di RNA nel citoplasma che ha anche affinità per PI. Introduzione di RNase A (50 mg / ml) a seguito di un passo di formaldeide 1% fissazione ritardo nella procedura di colorazione migliora sensibilmente la precisione di colorazione nucleare PI. Effetti negativi sono stati osservati in colorazione nucleare PI o membrana plasmatica annessina V colorazione. Senza RNAsi Un trattamento, fino al 40% dei risultati PI macchia può portare a falsi eventi positivi, che porta ad un impatto potenzialmente significativo e negativo sulle conclusioni a valle ^10.

La nostra modificato annessina V / PI protocollo di colorazione è semplice ed è stato utilizzato in modo efficace in un'ampia gamma di tipi di cellule (cellule primarie: murino macrofagi del midollo osseo e splenociti; suina cellule residenti del polmone, i macrofagi alveolari dei polmoni, isola dei linfonodi mesenterici, leucociti del sangue periferico , splenociti; cellule Blastoderm pollo; macrofagi reni pesci rossi primaria; leucociti del sangue periferico carpa; linee cellulari: RAW 264,7 macrofagi, le cellule T Jurkat, suina 3D4/31 macrofagi, CCL-71 fibroblasti pinna pesce rosso, pesce gatto 3B11 cellule B ^10). E 'importante notare che le cellule sono colpite in modo differenziato da falsi colorazione PI positivo, con pile in genere hanno un maggior numero di falsi eventi positivi ^10. La colorazione falsa PI differenze positive tra queste popolazioni cellulari può essere parzialmente attribuito a differenze di dimensioni delle cellule, ma può anche derivare da differenze nel contenuto di RNA. Come tale, l'incorporazione di questa procedura è particolarmente rilevante per i sistemi sperimentali che utilizzano, tra gli altri, cellule che subiscono lo stress genotossico, cellule trattate con farmaci arresto del ciclo cellulare come la timidina o idrossiurea, cellule infettate infettati, e gli studi sulle cellule embrionali in cui la progressione evolutiva è caratterizzato da variazioni discrete cellulari sintesi dell'RNA.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
1 x PBS-/-
1 x Annexin V Binding Buffer		BD Biosciences	556454
Annexin V-Alexa Fluor 488		Molecular Probes (Invitrogen)	A13201
Propidium iodide (PI)		Sigma-Aldrich	P4864	1 mg/mL in H2O
2% Formaldehyde		Sigma-Aldrich	F1268
RNase A from bovine pancreas		Sigma-Aldrich	R4642
DRAQ5		Biostatus	DR50050	Dilute 1:60 in 1 x PBS-/-