Summary
Hücre ölümü değerlendirilmesi için doğru bir yöntem açıklanmıştır. Protokol birincil hücre hücre hatları ve geniş bir yelpazede hayvan modellerinde% 40 yalancı pozitif olaylar kadar ekran geleneksel Annexin V / propidium iyodür (PI) protokolleri, üzerine geliştirir.
Abstract
Hücresel apoptozis Çalışmaları flow sitometri tabanlı yöntemler sunulmasından bu yana önemli ölçüde etkilendi. Propidium iyodür (PI) hücreler, plazma zarı bütünlüğü ve geçirgenliği 1,2 farklılıklar üzerinden, canlı, apoptotik veya nekrotik eğer belirlemek için yaygın Annexin V ile birlikte kullanılır. Annexin V / PI protokolü apoptotik hücre 3 çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır. Hücreleri 4,5 yaşayan boya hariç kapasitesini dayalı, ekonomik, istikrarlı ve hücre canlılığı iyi bir göstergedir, çünkü PI diğer nükleer lekeleri göre daha sık kullanılır. Bir hücreye girmek için PI yeteneği membran geçirgenliği bağlıdır; PI, sağlam bir plazma zarı 1,2,6 varlığı nedeniyle canlı ya da erken apoptotik hücre leke yapmaz . Geç apoptotik ve nekrotik hücreler, plazma ve nükleer membran bütünlüğünü sağlayarak, PI, membranlar yoluyla geçmesi, nükleik asitler içine enterkale ve kırmızı floresan 1,2,9 gösterilecek 7,8 azalır . Ne yazık ki, bu geleneksel Annexin V / PI protokollerini 10 sitoplazmik bölmesi içinde RNA PI boyama ile ilgili önemli sayıda yanlış pozitif olaylar (% 40), yol bulabilirsiniz. Gösteren yüksek oluşumu 10: (sitoplazmik oranları <0.5 nükleer) Birincil hücre ve hayvan modellerinde geniş bir yelpazede büyük hücreler ile hücre hatları etkilenir. Burada, geleneksel yöntemlere kıyasla hücre ölümü değerlendirilmesi için önemli bir gelişme sağlayan bir değiştirilmiş Annexin V / PI yöntemi göstermektedir. Bu protokol RNaz, boyama aşağıdaki hücre içine girişini teşvik etmek için hücre sabitleme sırasında hücresel geçirgenlik değişikliklerin yararlanır. Zamanlama ve RNaz konsantrasyonu her ikisi de bir sitoplazmik RNA kaldırılması için optimize edilmiştir. Sonuç olarak geleneksel Annexin V / PI protokolleri (sitoplazmik PI boyama <% 5 olaylar) üzerinde önemli bir gelişmedir.
Protocol
Bu prosedür, 500 mcL silikonlu tüpler veya 6 ml polistiren yuvarlak alt FACS tüpler yapılabilmektedir. İkincisi, diğer prosedürleri ile birlikte canlılığını analizi yaparken normal olarak kullanılır. 6 ml polistren yuvarlak alt FACS tüpler için verilen tüm birimleri. 500 mcL silikonlu borular için tüm birimler, 1 / 5 oranında azaltır.
Flow sitometri analizi için optimum konsantrasyonu 200 mcL hacim başına 2-4 x 10 6 hücre. Hücre kaybı bu yordamı neden olabilir ve böylece biz her numune prosedürün başlangıcında 4 x 10 6 hücre oluşur.
1. Hücre Hazırlık
- Hasat hücreleri - karşılık gelen hücre hatları veya birincil hücre izolasyonların için belirli prosedürleri bakın.
- 10 dakika boyunca 335 x g örnekleri santrifüj ve süpernatantı süzün.
- Süspanse edin hücreleri 2 mL 1 x fosfat tamponlu salin (PBS) / - (kalsiyum, magnezyum).
- 10 dakika boyunca 335 x g örnekleri santrifüj ve süpernatantı süzün.
- 1 ml 1 x Annexin V bağlayıcı tampon hücrelerin tekrar
- 10 dakika boyunca 335 x g örnekleri santrifüj ve süpernatantı süzün.
- 100 mcL 1 x Annexin V bağlayıcı tampon içinde süspanse edin hücreleri.
2. Annexin V / PI Uygulama Leke
- Üreticinin tavsiyelerine göre Annexin V [örneğin 5 mcL Annexin V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)].
- Karanlık tüpler 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Her reaksiyon tüpüne 1 x Annexin V bağlayıcı tampon 100 mcL ekleyin. Her bir tüp yaklaşık 200 mcL olmamalıdır.
- 1 x Annexin V bağlayıcı tamponu (yani x Annexin V bağlayıcı tampon 9 mcL 1 ile 1 mcL PI) 01:10 seyreltilmiş PI 4 mcL (Sigma, Kedi # P-4864-10ML) ekleyin. Bu, her örnek 2 mcg / ml son bir PI konsantrasyon verecektir.
- Karanlık tüpler 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Hücreleri yıkamak için 500 mcL 1 x Annexin V bağlayıcı tampon ekleyin.
- 10 dakika boyunca 335 x g örnekleri santrifüj ve süpernatantı süzün.
- 500 mcL 1 x Annexin V bağlayıcı tampon ve% 1 formaldehit (fiksatif) çözümü oluşturmak için 500 mcL% 2'lik formaldehit içinde süspanse edin hücreleri. Tüpler nazik hafifçe vurarak karıştırın.
- 10 dakika boyunca buz üzerinde örnekleri sabitleyin. Alternatif olarak, numuneler 4 gecede saklanan ° C karanlıkta. İkinci yöntem seçilirse, Annexin V / PI (tazminat kontrolleri dahil olmak üzere) etiketli tüm tüpler tutarlı emin olun.
- Her bir örnek ve hafifçe vurarak yavaşça karıştırın - / - 1 ml 1 x PBS ekleyin.
- Sekiz dakika için 425 x g tüpler Santrifüj ve süpernatant süzün.
- 2.10 ve 2.11 adımları tekrarlayın.
- Tüp Flicking tarafından süspanse edin pelet.
- 50 mcg / mL son bir konsantrasyon elde etmek 1:100 sulandırılmış RNaz A (Sigma, R4642) 16 mcL ekleyin. 37 az 15 dakika boyunca inkübe ° C.
- / - 1 ml 1 x PBS ekleyin ve hafifçe vurarak yavaşça karıştırın.
- Sekiz dakika için 425 x g tüpler santrifüjleyin.
- Numuneler analiz edilecek hazır. Annexin / PI boyama diğer prosedürleri ile paralel olarak yapılıyorsa Alternatif olarak, numuneler sonraki boyama adımlar için kullanılan olabilir.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
Hücre tipleri ve hücre hatları, yanlış pozitif PI boyanma değişen derecelerde örnekleri Şekil 1'de gösterilmiştir. (Şekil 2B) RNaz tedavi uğramadı hücrelere göre yanlış pozitif olayların sayısında önemli bir azalma yanlış pozitif olaylar için hesap için, hücreler fikse edildi ve daha sonra bu sonuçlar RNaz A. ile tedavi. Şekil 2C hiçbir RNaz tedavisi görmüş hücrelere kıyasla RNaz tedavi uygulandı hücreleri temsil eden görüntüler gösterir. Şekil 3 fiksasyon ve RNaz tedavi adımları ile modifiye Annexin V / PI protokolü, yanlış pozitif boyanma olayların sayısının sınırlandırılması geleneksel protokoller üzerinde nasıl geliştirdiğini gösteriyor.
Şekil 1. Konvansiyonel propidium iyodür boyama protokolleri önemli sayıda yanlış pozitif olayların yol açar. Daha önce, hayvan modellerinin çok geniş bir yelpazeden yanı sıra çeşitli hücre hatları 10 birincil hücreler boyunca yanlış pozitif boyanma yaygınlığı değerlendirilir . Temsilcisi görüntüleri üç benzersiz hücre popülasyonları (RAW makrofaj ve iki birincil hücreler fare kemik iliği makrofajlar (BMM) ve Japon balığı primer böbrek makrofajlar (PKM) yaygın olarak kullanılan hücre hattı) yanlış pozitif boyanma ölçüde göstermektedir. Gerçek pozitif olayların nükleer bölmesi içinde beklenen PI ve DRAQ5 arasındaki ortak lokalizasyonu (PI ve DRAQ5 sarı alanlar arasında ko tasvir) gösterir. DRAQ5 yüksek membrane geçirgen boya, canlı ve ölü hücreleri 10,11,12 hem doğru lekeleri nükleer bölmesi. Ko DRAQ5 daha kolay görsel tespiti için leke yeşil pseudocolour verildi.
Şekil 2. PI nükleer boyanma doğruluğunu artırma. (A) DRAQ5 için iyi karakterize nükleer lekeleri çok sayıda (BrdU, 7-AAD ve DAPI) benzerlik derecesine göre PI nükleer boyanma doğruluğu değerlendirildi. BrdU hızla çoğalan hücrelerin DNA içine dahil olup, sadece nükleer bölmesi gibi içinde leke sentetik bir nükleozid. 7-AAD, sağlam bir plazma zarı geçemez, PI benzer bir DNA yüksek afinite ve vardır. DAPI DNA için de güçlü bir ilgisi vardır ve en yaygın olarak kullanılan nükleer floresan mikroskopi leke. Doğru RAW 264,7 makrofaj hücre çekirdeğinde leke yeteneğini vurgulayarak, BrdU, 7-AAD, DAPI ve DRAQ5 arasında benzerlik derecesi>% 99 oldu. Buna karşılık, geleneksel protokoller dayalı sitoplazmik PI boyama DRAQ5 için göreli boyama yüzde benzerlik belirgin bir azalmaya yol açar. Fare kemik iliği makrofajlar (BMM) ve Japon balığı primer böbrek makrofajlar (PKM): (B) Benzer sonuçlar test iki birincil hücreler gözlenir. 50 mcg / ml RNaz A boyama prosedürü içinde belirli bir aşamada dahil edilmesi, nükleer olmayan PI boyama kaldırır ve DRAQ5 boyama göre benzerlik derecesi önemli ölçüde artırır. (C) primer böbrek makrofajlar Temsilcisi görüntüleri ve RNaz tedavi olmadan hücrelerin ölçüde benzerlik göstermektedir. Tedaviler arasında farklılıklar daha kolay görsel tespiti için, DRAQ5 yeşil verildi. Sarı alanlar arasında ko BrdU ve DRAQ5 ve PI ve DRAQ5 betimliyor.
Şekil 3. Modifiye Annexin V / PI yanlış apoptozis / nekrotik olaylar önemli ölçüde azaltır. İlköğretim goldfish böbrek makrofajlar (PKM), geleneksel ve modifiye Annexin V / PI protokolleri ile boyandı. Saçılım Annexin V / PI goldfish PKM leke betimliyor. Soldaki saçılım PKM hücrelerinin geleneksel Annexin V / PI boyama (RNaz yok) gösterir. Sağda saçılım modifiye Annexin V / PI protokolü (RNaz) ile boyandı PKM hücreleri gösterir. Ayrıca yanlış pozitif lekeleri kaldırılması nedeniyle PI boyama belirgin bir azalma RNaz sonuçları. PKM hücreler daha sonra farklı kültürlerin erken atalarıdır içinde nüfus (AP), monositler (Mono) ve olgun makrofajlar (Mat mac) dayalı analiz edildi. Yanlış pozitif olayların kaldırılması nedeniyle, olumlu PI olayların sayısında azalma, küçük erken progenitör hücreleri daha büyük olgun makrofaj hücreleri daha belirgindir. Geleneksel protokollerine dayalı sonuçlar hatalı hücre ölüme daha olgun makrofaj altkümelerini için pozitif bir korelasyon önerilen olurdu.
Discussion
Annexin V / PI protokolü burada sunulan geleneksel protokollerin değiştirilmiş bir sürümü ve PI için yüksek afinite sitoplazma RNA varlığı dikkate alır. Nükleer PI boyama boyama işlemi geç% 1 formaldehit fiksasyonu adım aşağıdaki RNaz A (50 mcg / ml) Giriş hassasiyeti önemli ölçüde artırır. Nükleer PI boyama veya plazma zarı Annexin V boyama olumsuz etkileri görülmektedir. RNaz bir tedaviye gerek kalmadan, PI leke sonuçlarının% 40 kadar downstream sonuçlar 10 bir potansiyel olarak anlamlı ve negatif bir etkiye yol açan yanlış pozitif olaylar, yol açabilir.
Modifiye Annexin V / PI boyama protokol basit ve hücre tipleri (İlköğretim hücreleri geniş bir yelpazede etkili bir şekilde kullanılır olmuştur: fare kemik iliği makrofaj ve dalak, domuz akciğer ikamet hücreleri, akciğer alveolar makrofajlar, mezenterik lenf nodu izolatları, periferik kan lökosit splenositlerin; tavuk blastodermin hücreler; goldfish birincil böbrek makrofajlar; sazan periferik kan lökosit, Hücre hatları: RAW 264,7 makrofajlar, Jurkat T hücreleri, domuz 3D4/31 makrofajlar, CCL-71 Japon balığı yüzgeci fibroblastlar, 3B11 kedibalığı B hücreleri 10). Hücreler farklı birincil hücreler genellikle yanlış pozitif olaylar (10) daha fazla sayıda olan yalancı pozitif PI boyama, etkilenen dikkat etmek önemlidir. Bu hücresel popülasyonlar arasındaki farklılıklar, yanlış pozitif PI boyama kısmen hücre boyutunda farklılıklar olabilir, ancak RNA içerik farklılıkları da neden olabilir. Bu yordamı, birleşme deneysel sistemler diğerleri arasında kullanmak, genotoksik stres geçiren hücreler, hücre döngüsü tutuklanması gibi timidin ya da hidroksiüre gibi ilaçlar, viral-enfekte olmuş hücreleri ve gelişim ilerlemesi embriyonik hücreler üzerinde çalışmaları ile tedavi edilen hücreler için özellikle ilgili olarak hücresel RNA sentezi ayrık değişiklikler ile karakterizedir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışmada, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Konseyi, Kanada (NSERC) araştırma bursu ve bir Alberta Tarım DRB Finansman Konsorsiyum hibe tarafından desteklenmiştir. AMR bir NSERC Vanier Kanada Yüksek Lisans Bursu, Alberta asistanlığa bir üniversite ve bir Kraliçe Elizabeth II yüksek lisans bursu ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x PBS-/- | |||
| 1 x Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| Annexin V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes, Life Technologies | A13201 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL in H2O |
| 2% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1268 | |
| RNase A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | Dilute 1:60 in 1 x PBS-/- |
References
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).
- Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).
- Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation. Apoptosis. 7, 41-47 (2002).
- Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data. J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).
- Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented. Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).
- Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13, 795-808 (1992).
- Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).
- Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors. Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).
- Faleiro, L., Lazebnik, Y. Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier. J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death. J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).
- Edward, R. Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells. Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).
- Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells. Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).
