Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Измененный Аннексин В / пропидия йодидом Апоптоз Пробирной для точной оценки клеточной смерти

doi: 10.3791/2597 Published: April 24, 2011

Summary

Точным методом оценки гибели клеток описывается. Протокол улучшает обычных Аннексин В / пропидий йодида (PI) протоколов, которые отображают до 40% ложно-положительных событий в клеточных линий и первичных клеток от широкого круга животных моделях.

Abstract

Исследования клеточного апоптоза было существенное влияние с момента появления проточной цитометрии основе методов. Пропидий йодида (PI) широко используется в сочетании с Аннексин V, чтобы определить, клетки жизнеспособны, апоптоза, или некротических через различия в плазме целостность мембраны и проницаемость 1,2. Аннексин V / PI протокол широко используется подход к изучению апоптоза клеток 3. П. И. используется чаще, чем у других ядерных пятна, потому что это экономично, стабильный и хороший показатель жизнеспособности клеток, основанный на его способности, чтобы исключить красителя в живых клетках 4,5. Способность П. И. войти клеток зависит от проницаемости мембраны; PI не окрашивает жить или в начале апоптоза клеток из-за присутствия нетронутыми плазматической мембраны 1,2,6. В конце апоптоза и некроза клеток, целостность плазмы и ядерной мембраны уменьшается 7,8, что позволяет PI проходить через мембраны, интеркалировать в нуклеиновые кислоты, а также отображать красной флуоресценции 1,2,9. К сожалению, мы обнаружили, что обычные Аннексин V / PI протоколов привести к значительным числом ложных положительных событий (до 40%), которые связаны с П. И. окрашивания РНК в цитоплазматических отсека 10. Первичные элементы и клеточных линий в широком диапазоне моделей на животных затронуты, с крупными ячейками (ядерное топливо: цитоплазматические отношения <0,5), демонстрирующий высшую возникновения 10. При этом, мы демонстрируем изменение Аннексин V / PI метод, который обеспечивает значительное улучшение оценки гибели клеток по сравнению с обычными методами. Этот протокол использует изменения в клеточной проницаемости в процессе клеточного крепления к содействию вступления РНКазы в клетки следующие окрашивания. Оба времени и концентрации РНКазы были оптимизированы для удаления цитоплазматической РНК. Результатом является значительное улучшение по сравнению с обычными Аннексин V / PI протоколов (<5% событий с окрашиванием цитоплазмы PI).

Protocol

Эта процедура может быть выполнена в 500 мкл силиконовая трубки или 6 мл полистирола с круглым дном FACS труб. Последний обычно используется при проведении анализа жизнеспособности в сочетании с другими процедурами. Все объемы указаны только для 6 мл полистирола с круглым дном FACS труб. Для 500 мкл силиконовая трубки, свести все объемы на 1 / 5.

Оптимальная концентрация для анализа потока цитометрии в 2-4 х 10 6 клеток на 200 мкл объема. Сотовые потери могут возникнуть в результате этой процедуры, и таким образом, мы рекомендуем, чтобы каждый образец состоит из 4 х 10 6 клеток в начале процедуры.

1. Сотовые подготовка

  1. Урожай клеток - ссылаться на конкретные процедуры для соответствующих клеточных линий или первичного выделения клеток.
  2. Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
  3. Ресуспендируют клеток в 2 мл 1 фосфат х солевым буфером (PBS) - / - (без кальция, магния нет).
  4. Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
  5. Ресуспендируют клеток в 1 мл 1 х Аннексин V буфера для связывания.
  6. Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
  7. Ресуспендируют клеток в 100 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания.

2. Применение Аннексин V / PI пятно

  1. Добавить Аннексин V в соответствии с рекомендациями производителя [например, 5 мкл Аннексин V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)].
  2. Инкубируйте труб в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре.
  3. Добавить 100 мкл 1 х Аннексин V обязательным буфер для каждой реакции трубки. Там должно быть около 200 мкл в каждую пробирку.
  4. Добавьте 4 мкл PI (Sigma, кат № Р-4864-10 мл), который был разбавленным 1:10 в 1 х Аннексин V связывающем буфере (т.е. 1 мкл PI с 9 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания). Это приведет к окончательной концентрации PI 2 мкг / мл в каждом образце.
  5. Инкубируйте труб в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре.
  6. Добавить 500 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания мыть клетки.
  7. Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
  8. Ресуспендируют клеток в 500 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания и 500 мкл 2% формальдегида для создания 1% формальдегида (фиксатором) решение. Смешайте трубы, осторожно стряхивая.
  9. Fix образцы на льду в течение 10 минут. Кроме того, образцы могут храниться в течение ночи при 4 ° С в темноте. Если последний метод был выбран, удостоверьтесь, чтобы быть последовательным во всех трубах помечены Аннексин V / PI (в том числе компенсации управления).
  10. Добавьте 1 мл 1 х PBS - / - для каждого образца и аккуратно перемешать, щелкая.
  11. Пробирки центрифужные в 425 х г в течение восьми минут и сцедить супернатант.
  12. Повторите шаги с 2.10 и 2.11.
  13. Ресуспендируют гранул, щелкая трубки.
  14. Добавить 16 мкл разбавленной 1:100 РНКазы (Sigma, R4642), чтобы дать конечной концентрации 50 мкг / мл. Инкубировать 15 минут при температуре 37 ° C.
  15. Добавьте 1 мл 1 х PBS - / - и аккуратно перемешать, щелкая.
  16. Пробирки центрифужные в 425 х г в течение восьми минут.
  17. Образцы теперь готовы для анализа. Кроме того, образцы можно использовать для последующих шагов, если окрашивание Аннексин / PI окрашивание выполняется параллельно с другими процедурами.

3. Представитель Результаты:

Примеры типов клеток и клеточных линий, которые имеют различные степени ложно-положительных П. И. окрашивания показаны на рисунке 1. Для учета ложно-положительных событий, клетки фиксируют, а затем обрабатывают РНКазы А. Это приводит к значительному уменьшению количества ложно-положительных событий, по сравнению с клетками, которые не прошли РНКазы лечения (рис. 2В). Рис 2С показывает, представитель изображений клеток, подвергшихся РНКазы лечения, по сравнению с клетками, которые не имеют лечения РНКазы. Рисунок 3 показывает, как изменение Аннексин V / PI протокол, с фиксацией и шаги РНКазы лечения, улучшает обычные протоколы, ограничивая число ложно-положительных событий окрашивания.

Рисунок 1
Рисунок 1. Обычные протоколы йодида пропидий окрашивания привести к значительным числом ложных положительных событий. Ранее мы оценивали степень ложноположительных окрашиванию через первичные элементы в широком диапазоне моделей на животных, а также в различных клеточных линиях 10. Представитель изображения показывают степень ложных срабатываний окрашивания в три уникальные клеточные популяции (обычно используются клеточные линии - RAW макрофагов и два первичных клеток - костного мозга мышиных макрофагов (БММ) и золотая рыбка первичной макрофагов почек (ПКМ)). Правда позитивных событий дисплей ожидается совместное локализации между ИП и DRAQ5 в ядерном отсеке (желтые области изображают колокализации между ИП и DRAQ5). DRAQ5 очень membraпе проницаемой краситель, который точно пятна ядерной отсеке и в живых и мертвых клеток 10,11,12. Для облегчения визуального определения колокализации DRAQ5 пятна был дан зеленый pseudocolour.

Рисунок 2
Рисунок 2. Более точное значение PI окрашивание ядер. () Мы оценили точность П. И. окрашивание ядер в зависимости от степени сходства ряда хорошо известных ядерных пятна (BrdU, 7-AAD и DAPI), чтобы DRAQ5. BrdU представляет собой синтетический нуклеозид, которая включена в ДНК пролиферирующих клеток, и как таковая будет только пятно в ядерном отсеке. 7-AAD имеет высокое сродство к ДНК и, как и ИП, не может пересечь нетронутыми плазматической мембране. DAPI также имеет сильное сродство к ДНК и является наиболее часто используемых ядерных пятном в люминесцентной микроскопии. Степень сходства было> 99% в период с BrdU, 7-AAD, DAPI и DRAQ5, выделяя их способность точно пятно клеточного ядра в RAW 264,7 макрофагов. В отличие от цитоплазматического окрашивания П. И. на основе традиционных протоколов приводит к заметному снижению процента сходство окраски по отношению к DRAQ5. (Б) Подобные результаты наблюдаются в двух первичных элементов протестированы: мышиных макрофагов костного мозга (БММ) и золотая рыбка первичной макрофагов почек (ПКМ). Включение 50 мкг / мл РНКазы на определенном этапе в течение окрашивания процедура удаляет неядерных П. И. окрашивания и значительно увеличивает степень сходства по отношению к DRAQ5 окрашивания. (C) представитель образы первичных макрофагов почек показать степень сходства для клеток с и без лечения РНКазы. Для облегчения визуального определения различия между процедурами, DRAQ5 был дан зеленый. Желтый областях изображают колокализации между BrdU и DRAQ5, П. И. и DRAQ5.

Рисунок 3
Рисунок 3. Измененный Аннексин V / PI значительно снижает ложные апоптоз / некротические события. Первичная золотая рыбка почек макрофагов (ПКМ) были окрашены обычной и модифицированной Аннексин V / PI протоколов. Диаграммы рассеяния изобразить Аннексин V / PI пятна в золотой рыбки ПКМ. Рассеяния слева показывает обычные Аннексин V / PI окрашивания (без РНКазы) из ПКМ клеток. Рассеяния справа показывает ПКМ клеток, окрашенных изменение Аннексин V / PI протокол (с РНКазы). Помимо результатов РНКазы в выраженное снижение PI окрашивания из-за удаления ложных положительных пятен. ПКМ клетки были затем проанализированы на основе различных групп населения в рамках культур-предшественников ранней (EP), моноцитов (моно) и зрелых макрофагов (Мат Mac). Сокращение числа позитивных событий П.И., из-за удаления ложных положительных событий является более выраженным в крупных зрелых клеток макрофагов, чем в небольших ранних клеток-предшественников. Выводы, основанные на традиционных протоколов бы ошибочно предложил положительную корреляцию в клеточной смерти для более зрелых подмножества макрофагов.

Discussion

Аннексин V / PI протокол, представленные здесь, модифицированной версией обычных протоколов и принимает во внимание наличие РНК в цитоплазме, которая также имеет высокое сродство к PI. Внедрение РНКазы (50 мкг / мл) после шага 1% формальдегида фиксации в конце процедуры окрашивания значительно улучшает точность ядерное окрашивание PI. Каких-либо негативных эффектов наблюдается в ядерных окрашивания ИП или плазматической мембраны Аннексин V окрашивания. Без РНКазы лечения, до 40% от PI пятно результаты могут привести к ложным положительным событиям, что приводит к потенциально значительные и негативное влияние на течение выводы 10.

Наши изменение Аннексин V / PI окрашивания протокол является простым и эффективно используется в широком диапазоне типов клеток (Первичные элементы: мышиные костного мозга макрофагами и спленоцитов; свиной клетки резидент легких, альвеолярных макрофагов легких, мезентериальных лимфатических узлов изоляты, лейкоцитов периферической крови , спленоцитов, клетки куриного бластодерма; золотая рыбка первичной макрофагов почек; карп лейкоцитов периферической крови; Клеточные линии: RAW 264,7 макрофагов, Т-клетки Jurkat, свиней 3D4/31 макрофаги, CCL-71 фибробласты золотые рыбки плавник, 3B11 сома В-клетки 10). Важно отметить, что клетки дифференциально пострадавших от ложных срабатываний окрашивания П.И., с первичной клетки в целом, имеющие большее количество ложных положительных событий 10. Различия ложноположительных окрашиванию PI среди этих клеточных популяций может быть частично связано с различиями в размер ячейки, но может также возникнуть в результате различий в содержании РНК. Таким образом, включение эта процедура особенно актуальна для экспериментальных систем, которые используют, в частности, клетки проходят генотоксического стресса, клетки, обработанные клеточного цикла препараты, такие как тимидина или гидроксимочевины, вирусно-инфицированные клетки, а также исследования на эмбриональных клетках, где развитие прогрессии характеризуется дискретные изменения в клеточном синтезе РНК.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано естественных наук и инженерного совета Канады (NSERC) исследовательский грант и Альберта сельского хозяйства Финансирование консорциума предоставлять DRB. AMR поддерживается посредством NSERC Ванье канадской высшей стипендии Университета Альберты ассистентом преподавания и королева Елизавета II выпускников стипендии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 x PBS-/-
1 x Annexin V Binding Buffer BD Biosciences 556454
Annexin V-Alexa Fluor 488 Molecular Probes, Life Technologies A13201
Propidium iodide (PI) Sigma-Aldrich P4864 1 mg/mL in H2O
2% Formaldehyde Sigma-Aldrich F1268
RNase A from bovine pancreas Sigma-Aldrich R4642
DRAQ5 Biostatus DR50050 Dilute 1:60 in 1 x PBS-/-

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).
  2. Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).
  3. Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation. Apoptosis. 7, 41-47 (2002).
  4. Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data. J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).
  5. Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented. Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).
  6. Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13, 795-808 (1992).
  7. Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).
  8. Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors. Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).
  9. Faleiro, L., Lazebnik, Y. Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier. J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).
  10. Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death. J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).
  11. Edward, R. Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells. Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).
  12. Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells. Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).
Измененный Аннексин В / пропидия йодидом Апоптоз Пробирной для точной оценки клеточной смерти
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. J. Vis. Exp. (50), e2597, doi:10.3791/2597 (2011).More

Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. J. Vis. Exp. (50), e2597, doi:10.3791/2597 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter