En korrekt metod för bedömning av celldöd beskrivs. Protokollet förbättrar konventionella Annexin V / propidiumjodid (PI) protokoll, som visar upp till 40% falskt positiva händelser i cellinjer och primära celler från ett brett urval av djurmodeller.
Studier av cellulära apoptos har i betydande utsträckning påverkats sedan införandet av flödescytometri-baserade metoder. Propidiumjodid (PI) används ofta i kombination med Annexin V för att avgöra om cellerna är livskraftiga, apoptotiska eller nekrotiska genom skillnader i plasmamembranet integritet och permeabilitet 1,2. Den Annexin V / PI-protokollet är ett vanligt tillvägagångssätt för att studera apoptotiska celler 3. PI används oftare än andra kärntekniska fläckar eftersom det är ekonomiskt, stabilt och en bra indikator på cellviabiliteten, baserat på dess förmåga att utesluta färga i levande celler 4,5. Möjligheten för PI att ange en cell är beroende av permeabiliteten i membranet, PI inte fläckar bor eller i början av apoptotiska celler på grund av närvaron av en intakt plasmamembran 1,2,6. I slutet av apoptotiska och nekrotiska celler, minskar integritet plasma och nukleära membran 7,8, vilket gör att PI att passera genom membranen, intercalate i nukleinsyror och visa röd fluorescens 1,2,9. Tyvärr finner vi att konventionella Annexin V / PI protokoll leda till ett stort antal falskt positiva händelser (upp till 40%), som är förknippade med PI färgning av RNA inom cytoplasmiska facket 10. Primära celler och cellinjer i ett brett urval av djurmodeller är drabbade, med stora celler (kärnkraft: cytoplasmiska nyckeltal <0,5) visar den högsta förekomsten 10. Häri visar vi en modifierad Annexin V / PI-metoden som ger en signifikant förbättring för bedömning av celldöd jämfört med konventionella metoder. Detta protokoll tar fördel av förändringar av cellens permeabilitet under cellen fastställande underlätta inträdet av RNas A till cellerna efter färgning. Både tidpunkten och koncentration av RNas A har optimerats för borttagning av cytoplasmiska RNA. Resultatet är en betydande förbättring jämfört med konventionella Annexin V / PI-protokoll (<5% händelser med cytoplasmisk PI färgning).
Den Annexin V / PI-protokollet som presenteras här är en modifierad version av vanliga protokoll och tar hänsyn till förekomsten av RNA i cytoplasman som också har hög affinitet för PI. Införande av RNas A (50 mikrogram / ml) efter en 1% formaldehyd fixering steg sent i färgningsproceduren förbättrar avsevärt riktigheten av kärntekniska PI färgning. Inga negativa effekter har observerats i nukleär PI färgning eller plasmamembranet Annexin V färgning. Utan RNas En behandling kan upp till 40% av PI fläcken resultat leda till falskt positiva händelser, vilket leder till en potentiellt betydande och negativ påverkan på nedströms slutsatser 10.
Vår modifierad Annexin V / PI färgningsprotokollet är enkel och har använts effektivt i en rad olika celltyper (Primärceller: murina benmärg makrofager och splenocytes, svin lunga bosatt celler, lung-alveolära makrofager, kröslymfknutor nod isolat, perifert blod leukocyter , splenocytes, kyckling BLASTODERM celler; guldfisk primära njure makrofager, karp perifera leukocyter, cellinjer: RAW 264,7 makrofager, Jurkat T-celler, svin 3D4/31 makrofager, CCL-71 guldfiskar fin fibroblaster, 3B11 havskatt B-celler 10). Det är viktigt att notera att cellerna differentiellt påverkas av falskt positiva PI färgning, med primära celler i allmänhet har ett större antal falskt positiva händelser 10. Skillnaderna falskt positiva PI färgning bland dessa cellpopulationer kan delvis hänföras till skillnader i cellstorlek, men kan också beror på skillnaden i RNA innehåll. Som sådan, införlivande av detta förfarande är särskilt relevant för experimentella system som använder bland annat celler genomgår genotoxiska stress, celler som behandlats med gripandet cellcykeln droger som tymidin eller hydroxiurea, viralt-infekterade celler, och studier på embryonala celler där utvecklande progression kännetecknas av diskreta förändringar i cellulärt RNA syntes.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie fick stöd av en naturvetenskaplig och teknisk Council of Canada (NSERC) forskningsanslag och ett Alberta Jordbruk Finansiering Consortium bidrag till DRB. AMR stöds genom en NSERC Vanier kanadensiska Graduate Scholarship, University of Alberta undervisning assistent och en drottning Elizabeth II examen stipendium.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
1 x PBS-/- | ||||
1 x Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | ||
Annexin V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes (Invitrogen) | A13201 | ||
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL in H2O | |
2% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1268 | ||
RNase A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R4642 | ||
DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | Dilute 1:60 in 1 x PBS-/- |