Lípidos vesículas mediada por cromatografía de afinidad utilizando magnética clasificación de células activadas (LIMACS): un nuevo método para analizar la interacción de proteínas y lípidos
Summary
Para probar la interacción de una proteína con su objetivo de lípidos se utilizó MACS y anexina V conjugada con partículas magnéticas y de las vesículas de lípidos sintetizados a partir de los lípidos de destino y fosfatidilserina anexina V vinculante. Proteínas unidas a los lípidos de destino se co-purificados y analizados después de la elución de las cuentas.
Abstract
El análisis de la interacción lípido proteína es difícil debido a los lípidos están incrustados en las membranas celulares y, por tanto, inaccesible para la mayoría de los procedimientos de purificación. Como alternativa, los lípidos pueden estar recubiertas por superficies planas que se utilizan para lípidos ELISA y resonancia de plasmones de la espectroscopia. Sin embargo, los lípidos de la superficie de revestimiento no forman microdominios estructuras, que pueden ser importantes para las propiedades de unión de lípidos. Además, estos métodos no permiten la purificación de grandes cantidades de proteínas de unión a los lípidos de su objetivo.
Para superar estas limitaciones de las pruebas de interacción de proteínas y lípidos para purificar las proteínas de unión de lípidos, hemos desarrollado un nuevo método denominado vesícula lipídica mediada por cromatografía de afinidad utilizando magnético activado por la selección de células (LIMACS). En este método, las vesículas de lípidos son preparados con el objetivo de lípidos y la fosfatidilserina como los lípidos de anclaje para anexina V MACS. Fosfatidilserina es un fosfolípido de la membrana celular omnipresente que muestra una alta afinidad a la proteína anexina V. Con perlas magnéticas conjugadas con anexina V de las vesículas de lípidos que contienen fosfatidilserina se unen a las bolas magnéticas. Cuando las vesículas lipídicas se incuban con un lisado celular de la proteína de unión a los lípidos objetivo también tendrá la obligación de las cuentas y puede ser co-purificado utilizando MACS. Este método también se puede utilizar para comprobar si las proteínas recombinantes reconstruir un complejo de proteínas de unión a los lípidos de destino.
Hemos utilizado este método para mostrar la interacción de la PKC atípicas (aPKC) con la ceramida esfingolípidos y co-purificar respuesta apoptosis de próstata 4 (PAR-4), una proteína de unión a la ceramida asociada aPKC. También hemos utilizado este método para la reconstitución de un complejo de ceramidas asociados de aPKC recombinante con la célula relacionados con la polaridad de las proteínas PAR6 y Cdc42. Desde las vesículas de lípidos pueden ser preparados con una variedad de sphingo o fosfolípidos, LIMACS ofrece una prueba versátil para la interacción lípido-proteína en un ambiente de lípidos que se parece mucho a la de la membrana celular. Otros complejos de lípidos y proteínas pueden ser identificadas mediante análisis de proteómica de proteínas de unión de lípidos co-purifica con las vesículas lipídicas.
Protocol
Discussion
Para probar la interacción específica entre un lípido y su unión a proteínas se ve obstaculizada por la incrustación de los lípidos de la membrana celular. La membrana celular consiste en una mezcla de lípidos y proteínas de varios y se organiza en microdominios lipídicos o balsas. Por lo tanto, la co-purificación de microdominios y las proteínas no se pueden distinguir claramente si una proteína se une directamente a un lípido o sólo se enriquece en una estructura de microdominios. Otros métodos que uti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el NIH y R01NS046835 R01AG034389, y la March of Dimes conceder 6FY08-322. Un agradecimiento especial se dedica a la Sra. Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), que ayudó enormemente con su visión de la tecnología MACS. Miltenyi ha ofrecido generosamente el material utilizado para la demostración de los experimentos, sin costo alguno. También estoy agradecida con el Dr. Wang Guanghu (Medical College of Georgia / Georgia Universidad Ciencias de la Salud, Augusta, GA), que generó la PKCζ líneas celulares que expresan. Apoyo del Instituto de Medicina Molecular de la Facultad de Medicina de Georgia / Ciencias de la Salud de la Universidad de Georgia (bajo dirección del Dr. Lin Mei) también se reconoce.
Materials
Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns were provided by Miltenyi Biotec, Inc. (Auburn, CA). All lipids were of highest purity and obtained from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).
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