Summary
우리가 맥스와 Annexin V - 복합 자석 구슬과 대상 지질 및 Annexin V - 구속력 phosphatidylserine의 합성 지질 vesicles를 사용하여 자사의 목표 지질과 단백질의 상호 작용을 테스트하려면. 대상 지질에 바인딩 단백질은 공동 정화 및 비즈에서 용출 후 분석하고 있습니다.
Abstract
lipids 대부분의 정화 절차에 접근할 그러므로 세포 점막에 포함된하고 있기 때문에 지질 단백질 상호 작용의 분석 어렵습니다. 대안으로, lipids은 지질 엘리사와 Plasmon 공명 분광법을 위해 사용되는 평면 표면에 코팅하실 수 있습니다. 그러나, 표면 코팅 lipids은 지질 바인딩 속성에 대해 중요한 수있는, microdomain 구조를 형성하지 않습니다. 또한, 이러한 방법들은 목표 lipids에 바인딩 단백질의 대용량의 정화를 위해 허용하지 않습니다.
지질 단백질 상호 작용을 테스트 이러한 한계를 극복하고 지질 바인딩 단백질을 정화하기 위해 우리는 자기가 활성화된 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 친화 크로마 토그래피를 칭했다 소설 방법을 개발했습니다. 이 방법에서는 지질 vesicles는 Annexin V Mac 용 앵커 지질로 대상 지질 및 phosphatidylserine와 준비가되어 있습니다. Phosphatidylserine는 단백질 Annexin V. phosphatidylserine 함유 지질 vesicles는 자성 비즈에 바인딩됩니다 Annexin V에 복합 자기 구슬을 사용하여 높은 친화력을 보여주는 유비 쿼터스 세포막의 인지질이다. 지질 vesicles이 lysate 세포와 incubated 경우 대상 지질에 바인딩 단백질도 비즈에 바인딩되며, 맥을 사용하는 공동 정화 수 있습니다. 이 방법은 테스트하는 데 사용할 수있는 재조합 단백질은 reconstitute 대상 지질에 바인딩 단백질 컴플렉스를하는 경우.
우리는 sphingolipid ceramide와 공동 정화 전립선 apoptosis 반응 4 (파 4), ceramide - 관련 aPKC에 바인딩 단백질 비정형 PKC (aPKC)의 상호 작용을 표시하기 위해이 방법을 사용했습니다. 우리는 또한 세포 극성과 관련된 단백질 Par6 및 Cdc42와 재조합 aPKC의 ceramide - 연결된 복합 reconstitution이 방법을 사용했습니다. 지질 vesicles가 sphingo 또는 phospholipids의 다양한 준비할 수 있기 때문에 LIMACS은 세포막의 밀접하게 유사한 지질 환경에서 지질 - 단백질 상호 작용에 대한 다양한 테스트를 제공합니다. 추가 지질 단백질 단지는 지질 바인딩 단백질 지질 vesicles 공동 정화의 proteomics 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다.
Protocol
1. 소개
자기 - 활성화된 셀 정렬 (LIMACS) 기법을 사용하여 지질 소포 - 중재 친화 크로마 토그래피는 ceramide - 관련 단백질 단지가 1-3 분리하기 위해 연구실에서 개발되었습니다. 원래, 지질 vesicles는 vesicles과 관련된 단백질을 분리하는 자기 입자 - 복합 Annexin V를 (phosphatidylserine 고도로 affine)를 사용하여 Mac 용 허용 ceramide와 phosphatidylserine의되었다. 이 ceramide - 연결된 극성 복잡하고 세포에서 ceramide 결합 단백질의 분리의 체외의 reconstitution에 3 lysates 위해 우리는 LIMACS 기술을 사용해 왔습니다. LIMACS은 vesicles (예 : glycolipid - specifc lectins 또는 지질 항체)의 절연 다른 상호 작용 파트너를 사용하여 수정할 수 있습니다.
2. 실험 절차
지질 Vesicles 및 aPKCBinding Assays의 준비
- 지질 vesicles은 phosphatidylserine (105 μg)과 대형 리포좀 준비 1,4-7에 대한 변경 절차는 다음과 C16 - ceramide (85 μg)의 몰 금액의 건조 혼합물에서 얻을 수 있습니다.
- 지질 혼합물은 다음 resuspended 50 MM 트리스 / HCL (산도 7.5) 150 MM NaCl로 구성된 소포 버퍼 100 μl 1 H에 대한 sonicated 수 있습니다.
- 0.1 MM MnCl 2 보충 소포 버퍼 300 μl를 추가 후, 샘플 4 20 분 12,000 μ의 g ° C.에 centrifuged 아르
- 펠렛은 (대형 지질 vesicles) 소포 버퍼 100 μl에 resuspended 37 1 H에 대한 Vybrant CM - diI 1 nmol와 incubated 있습니다 ° C가 맥 분리 후 소포 분획을 시각화합니다. Vybrant CM - diI 특별히 지질 세포막에 통합 빨간색 형광 염료이다.
- 세제없는 세포 lysate은 원심 분리에 의해 막의 파편의 제거 다음 hypotonic 버퍼 (프로 테아제와 인산 가수 분해 효소 억제제 10 MM 트리스 / HCL (산도 7.0)) 300 μl에 sonication / 세포의 균질로 준비가되어 있습니다. 1 H 100,000 XG에서 원심 분리 단계는 phosphatidylserine를 포함하는 내생 세포막과 세포 lysate의 오염을 방지하기 위해 추가되어야합니다.
- 삭제 lysate은 지질 소포의 정지에 추가하고, 혼합물은 4 ° C. 2 H에 대한 incubated입니다
- 반응 혼합물은 20x Annexin V 구속력 버퍼와 Annexin V에 복합 자기 구슬을 포함하는 솔루션을 50 μl 20 μl로 보충됩니다 4 1 H ° C.위한 인큐베이션 다음
- 맥스는 제조 업체 (Miltenyi Biotec (주)) 프로토콜에 따라 수행됩니다. 지질 vesicles의 존재와 수량은 microplate 형광 판독기를 사용하여 흐름 통해 용출 분수에 Vybrant CM - diI의 형광을 모니터링에 의해 결정됩니다.
- 기공을 갖는 지질의 금액과 형광 강도 사이의 선형 상관 관계 소포 - 바운드 Vybrant CM - diI는 Annexin V - 기반 Mac에 적용된 지질 혼합물의 양적 고성능 박막 크로마 토그래피 (HPTLC)에 의해 확인됩니다.
- ceramide / phosphatidylserine vesicles에 aPKC 또는 다른 단백질의 바인딩 반응의 특이성은 ° C 부화하기 전에 4 개의 1 H에 대한 세포 lysate를 부화 방지 PKCζ 토끼 polyclonal 항체의 1 μg을 사용하여 항체의 경쟁 분석에 의해 확인 지질은 vesicles.
- 맥스 eluate에서 ceramide / phosphatidylserine vesicles에 바인딩 단백질은 SDS - PAGE와 immunoblotting으로 분석됩니다.
체외 지질 - 단백질 복합 극성에
- 지질 - 단백질 극성 복합 체외의 reconstitution의는 이전 섹션에서 설명한대로 LIMACS 과정을 수행합니다. 간단한, phosphatidylserine (420 μg)과 C16 - ceramide (107 μg)에서 유기 용매의 건조이다.
- 말린 lipids은 소포 버퍼 500 μl (; 150 MM NaCl 50 MM 트리스 / HCL, 산도 7.5)에서 sonication 아래 resuspended 있습니다.
- 10 MM MnCl2, Vybrant CM - diI 1 μl, 그리고 PKCζ 500 NG (인간 재조합)의 다섯 μl가 추가되고 반응 혼합물은 4 60 분 undergentle의 교반을 incubated 있습니다 ° C.
- Vybrant CM - diI 묻은 phosphatidylserine / ceramide vesicles 4에서 60 분 ° C.에 대한 12,000 XG에서 원심 분리하여 회수 아르
- 펠렛 (분홍색)을 100 μl 트리스 버퍼에 resuspended 및 γS - GTP (100 μm의), GDP (1 ㎜), GST - Par6 (100 NG) 또는 GST - Cdc42 (500 NG)과 보완 및 추가 3 incubated입니다 4 H ° C (관심 재조합 단백질의 다른 조합이 여기에 사용할 수 있습니다.)
- Annexin V - 버퍼 (20x 재고 솔루션 5 μl)와 Annexin V - 복합 자석 구슬이 (50 μl) 추가하고 반응 혼합물은 4에서 다른 30 분 ° C.에 대한 부드러운 교반하에 incubated 아르
- Annexin V - 맥스는 이전에 설명한대로 공급 업체의 프로토콜을 다음과 수행됩니다. 용출 분획 (1 ML)는 강수량의 도움으로 순수 ovalbumin 10 μg로 보충합니다. 단백질은 위셀 - 플러그의 석출에 의해 집중하고 이전 8 설명된대로 SDS-PAGE/immunoblotting 의해 분석됩니다.
- eluted 지질 vesicles의 금액은 위셀 플러그의 침전 반응의 유기적 (클로로포름 / 메탄올) 단계에서 Vybrant CM - diI (분홍색)의 검출에 의해 계량입니다. 분석 단백질의 양은 지질 vesicles 동등한 양의에 정상화됩니다.
3. 검색 결과
LIMACS의 PKCζ - EGFP의 정화와 ceramide 바인딩 도메인 C20ζ - EGFP
전체 길이를 표현 MDCK 세포의 세제 무료 lysate PKCζ C - 말기 녹색 형광 단백질 (FLζ - EGFP) 또는 PKCζ (C20ζ - EGFP)의 C - 말단에서 ceramide 바인딩 도메인에 연결된 것은 같은 phosphatidylserine / ceramide vesicles와 incubated되었습니다 실험 절차에 설명되어 있습니다. 맥에서 열 용출 후, 단백질은 immunoblotting 및 eluted 단백질 2의 검출에 대한 PKCζ와 EGFP에 대한 항체를 사용하여 분석했다.
그림 1. LIMACS EGFP - 라벨 PKCζ과 C - 말단 조각 C20ζ phosphatidylserine / ceramide vesicles를 사용합니다.
실험 절차 섹션에 설명된대로 EGFP (구속력 제어 등), 전체 길이 PKCζ - EGFP 또는 ceramide 바인딩, C - 말단 조각 C20ζ - EGFP을 표현 MDCK 세포의 세제 무료 lysates은 phosphatidylserine / ceramide의 vesicles와 incubated되었습니다 . LIMACS을 사용한 후, 단백질은 SDS 샘플 버퍼 eluted되었으며 SDS - PAGE로 분석 및 immunoblotting. 왼쪽 패널은 EGFP는 Annexin V - 연결된 자석 구슬로 유지 vesicles에 바인딩 않았 것으로 나타났습니다. 중간과 오른쪽 패널은 전체 길이 PKCζ - EGFP와 C20ζ - EGFP 인해 ceramide에 바인딩 유지했다. 보여줍니다
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Discussion
지질과 결합 단백질 간의 특정 상호 작용을 테스트하려면 것은 세포막의 lipids의 포함에 의해 방해합니다. 세포막은 여러 lipids과 단백질의 혼합물로 구성되어 있으며, 그것은 지질 microdomains이나 보트로 구성됩니다. 단백질 직접 지질에 바인딩 또는 유일한 microdomain 구조에 풍부한 경우 따라서 microdomains 및 단백질의 공동 정화 명확하게 구별 수 없습니다. 이러한 지질 ELISAs 또는 Plasmon 공명 분광법으로 표면에 코팅 정의 lipids를 사용하는 다른 방법은 바인딩 단백질과 특정 지질의 상호 작용을 감지할 수 .. 그러나, 생리학 관련 멤브레인 환경에서 표면 (예를 들어, Plasmon 공명 분광법을위한) 지질 vesicles 또는 liposomes로 코팅되어야한다를이 상호 작용을 결정합니다.
우리는이 이전 방법의 대안으로 소설 지질 소포 바인딩 분석을 개발했습니다. 참신는 Annexin V - 복합 자석 구슬과 지질 vesicles의 절연을 허용 vesicles로 앵커 지질 (phosphatidylserine)를 통합에서 비롯됩니다. 따라서, 우리는 자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여이 분석 지질 소포 - 중재 선호도 크로마 토그래피를 칭했다. LIMACS가 내생 단백질에 대해 수행할 수, 세포, 또는 재조합 단백질의 표현 단백질은 지질 단백질 복합에 1-3 재구성.
지질 vesicles에 바인딩 단백질 그런 다음 단순히 자석 스탠드에서 맥 컬럼을 복용하고 적절한 버퍼로 eluting하여 복구할 수 있습니다. 이것은 SDS - PAGE를 사용하고 immunoblotting 단백질 분석을 수행할 수있는 eluate 또는 SDS 샘플 버퍼에있는 효소 활동을 측정하는 효소 호환 버퍼 수 있습니다. SDS 샘플 버퍼를 사용하는 경우 맥을 열은 스탠드에 자석 구슬을 보유를 허용 마그네틱 스탠드에서 제거 필요가 없습니다.
LIMACS를 사용할 때주의가 필요하다 예방 조치가 있습니다. 이것은 지질 vesicles를 파괴하기 때문에 결국, LIMACS는 세제 lysate와 함께 사용할 수 없습니다. 또한이 지질은 Annexin V - 복합 자석 구슬에 vesicles의 바인딩을위한 앵커로 사용하기 때문에 대상 지질의 바인딩 단백질도 phosphatidylserine에 바인딩하는 경우 테스트되어야한다. . 어떤 경우에는, phosphatidylserine의 타겟 단백질에 바인딩을 해칠 수 있습니다. 따라서, phosphatidylserine의 다양한 양의와 부정적인 컨트롤과 컨트롤은 분석에 포함해야합니다. Thesecontrols 쉽게에만 phosphatidylserine 또는 구속력 lipids과 phosphatidylserine의 혼합물을 포함하는 지질 vesicles를 사용하여 수행할 수 있습니다. 포함 부정적인 컨트롤도 내생 phosphatidylserine의 상당한 금액을 포함하는 세포 lysates 필요합니다. 그것이 1 H. 100,000 XG에서 ultracentrifugation 단계를 포함하여 세포 lysate을 취소하는 것이 좋습니다 내생 지질 세포막이나 vesicles과 오염을 방지하려면 그것은 표면에 뜨는에서 지질 바인딩 단백질에만 LIMACS 절차의 제한 사항입니다 cytosolic, 수있다 분명하다. 이러한 GM1과 자석 구슬과 함께 복합 콜레라 독소 B 급 subunit 같은 다른 앵커 lipids에 LIMACS을 확장할 수있는 가능성이있다.
우리는 현재 vesicles의 준비를위한 앵커 lipids의 사용이 필요 할거 LIMACS에 대한 지질 특정 항체의 사용을 모색하고 있습니다. LIMACS의 유익한 측면 중 하나는 implementable되지 않은 단백질 분석 방법의 다양한 수있는 지질 단백질 복합의 격리는 ... 예를 들어, 우리는 ceramide - 바운드 aPKC과 관련된 Par6/Cdc42의 재구성 극성 단백질 복잡한 분리 LIMACS를 사용했습니다. 따라서, LIMACS는 지질 관련 단백질 단지의 분석 및 분리를위한 강력한 새로운 방식입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 R01NS046835과 R01AG034389, 그리고 천 부여 6FY08 - 322 3 월 지원했다. 특별한 당신이 맥을 기술에 그녀의 통찰력과 함께 엄청난 도움을 부인 엘리 노어 브라운 (Miltenyi Biotec, 오번, CA)에 전념합니다 감사합니다. Miltenyi은 아낌없이 무료로 실험의 시연에 사용되는 자료를 제공하고 있습니다. 또 세포 라인을 표현 PKCζ을 생성 박사 Guanghu 왕 (조지아 / 조지아 보건 과학 대학, 오거 스타의 메디컬 칼리지, GA)에 감사드립니다. 조지아 / 조지아 보건 과학 대학 (박사 린 메이의 지도자의 임기 미만)의 의료 대학에서 분자 의학 연구소에 의해 지원도 인정받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns | Miltenyi Biotec | ||
| Lipids (of highest purity) | Avanti Polar Lipid, Inc |
References
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