Summary
لاختبار مدى تفاعل البروتين الدهني مع هدفها كنا MACS وAnnexin V - مترافق الخرز المغناطيسي وحويصلات الدهنية من الدهون المركبة المستهدفة وAnnexin فسفاتيديل V - ملزمة. هي بروتينات الدهنية منضم إلى الهدف المشترك تنقيتها وتحليلها بعد شطف من الخرز.
Abstract
تحليل التفاعل البروتين الدهني صعب جدا ، لأن جزءا لا يتجزأ من الدهون في أغشية الخلايا ، وبالتالي ، لا يمكن الوصول إليها إلى إجراءات أشد تنقية. كبديل ، يمكن أن تكون مغلفة الدهون على الأسطح المسطحة كما تستخدم لمأكل مثل الطحين والدهن ELISA الطيفي بالرنين. ومع ذلك ، والدهون طلاء السطح لا تشكل هياكل microdomain ، والتي قد تكون مهمة لخصائص الربط الدهون. مزيد من هذه الطرق لا تسمح لتنقية كميات أكبر من البروتينات ملزمة الدهون المستهدفة.
للتغلب على هذه القيود المفروضة على اختبار البروتين الدهني التفاعل وتنقية البروتينات الشحمية ملزمة طورنا طريقة جديدة تسمى اللوني الدهون تقارب حويصلة بوساطة استخدام الفرز المغناطيسي تنشيط الخلية (LIMACS). في هذه الطريقة ، يتم إعداد حويصلات الدهن مع وجود الهدف والدهون مثل الدهون فسفاتيديل مرساة لMACS Annexin الخامس. فسفاتيديل هو غشاء الخلية التي تظهر في كل مكان فسفوليبيد تقارب عالية لبروتين خامسا Annexin باستخدام الخرز المغناطيسي مترافق إلى الخامس Annexin الحويصلات التي تحتوي على الدهون فسفاتيديل سوف ربط الخرز المغناطيسي. متى يتم تحضين الحويصلات الدهون مع خلية lysate أيضا البروتين الدهني ملزما للهدف أن تكون ملزمة للالخرز ويمكن أن يشترك في تنقية MACS به. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لمعرفة ما إذا البروتينات المؤتلف إعادة مجمع البروتين الدهني ملزما للهدف.
وقد استخدمنا هذا الأسلوب لإظهار التفاعل بين PKC شاذة (aPKC) مع سيراميد الشحميات السفينغولية وشارك في تنقية استجابة الخلايا البروستاتا 4 (PAR - 4) ، وهو بروتين ملزمة لسيراميد المرتبطة aPKC. وقد استخدمنا هذا الأسلوب أيضا لإعادة هيكلة مجمع سيراميد المرتبطة من aPKC المؤتلف مع الخلية القطبية ذات الصلة والبروتينات Par6 Cdc42. حيث يمكن إعداد حويصلات الدهنية مع مجموعة متنوعة من الدهون الفوسفاتية أو sphingo ، LIMACS يقدم تنوعا لاختبار البروتين الدهني التفاعل في بيئة الدهون التي تمثل بشكل وثيق من أن غشاء الخلية. يمكن التعرف على البروتين الدهني إضافية المجمعات باستخدام تحليل البروتينات من البروتين الدهني الملزم الذي اشترك في المنقى مع حويصلات الدهنية.
Protocol
1. مقدمة
تم تطوير اللوني الدهون تقارب حويصلة بوساطة استخدام الفرز المغناطيسي تنشيط الخلية (LIMACS) تقنية في المختبر لدينا لعزل بروتين المجمعات سيراميد المرتبطة 1-3. في الأصل ، أدلى الحويصلات الدهني سيراميد وفسفاتيديل ، مما سمح لMACS باستخدام الجسيمات المغناطيسية مترافق Annexin الخامس (أفيني للغاية لفسفاتيديل) لعزل الحويصلات والبروتينات المرتبطة بها. وقد استخدمنا أسلوب LIMACS لإعادة المختبر في مجمع الاقطاب سيراميد المرتبطة وعزل سيراميد ملزم البروتينات من الخلية lysates 3. يمكن تعديل LIMACS به الشركاء التفاعل أخرى لعزل الحويصلات (على سبيل المثال ، شحمي سكري ، أو الأجسام المضادة specifc lectins الدهن).
2. الإجراءات التجريبية
إعداد الحويصلات الدهن وفحوصات aPKCBinding
- ويتم الحصول على حويصلات الدهنية من الخلائط المجففة من المبالغ متساوي المولية للفسفاتيديل (105 ميكروغرام) و C16 - سيراميد (85 ميكروغرام) وفقا للإجراءات معدلة لإعداد الحويصلية 1،4-7 كبيرة.
- ومعلق ثم خليط الدهن وsonicated ل 1 ح في 100 ميكرولتر من العازلة حويصلة تتكون من تريس 50 مم / حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.5) و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم.
- بعد إضافة 300 ميكرولتر من حويصلة العازلة تستكمل مع MnCl 0.1 ملم 2 ، يتم طرد هذه العينات في ز μ 12000 لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- هو معلق على بيليه (حويصلات الدهنية الكبيرة) في 100 ميكرولتر من حويصلة العازلة وحضنت مع 1 nmol من Vybrant الجاذبة - CM : 1 ساعة عند 37 درجة مئوية لتصور جزء الحويصلة بعد الانفصال MACS. Vybrant CM - الجاذبة هو صبغ أحمر فلوري دمج تحديدا في الأغشية الدهنية.
- ويتم إعداد المنظفات الخالية من lysate الخلية صوتنة / التجانس من الخلايا في 300 ميكرولتر من ناقص التوتر العازلة (10 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك (7.0 درجة الحموضة) ومثبطات الأنزيم البروتيني مع الفوسفاتيز) ، يليه إزالة الحطام الغشائي بواسطة الطرد المركزي. وينبغي أن يضاف خطوة الطرد المركزي في 100000 XG ل 1 ح لتجنب تلوث lysate الخلية أغشية داخلية تحتوي على فسفاتيديل.
- إضافة إلى مسح lysate الدهون تعليق الحويصلة ، وحضنت الخليط لمدة 2 ساعة عند 4 درجة مئوية.
- ثم تستكمل خليط التفاعل مع 20 ميكرولتر من 20X العازلة الخامس Annexin ملزم و 50 ميكرولتر من محلول يحتوي على حبات المغناطيسي مترافق إلى الخامس Annexin بواسطة الحضانة لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- يتم تنفيذ MACS وفقا لالصانع (Miltenyi بيوتيك ، وشركة) البروتوكول. يتم تحديد وجود وكمية من الدهون الحويصلات عن طريق رصد Vybrant CM - الجاذبة مضان في التدفق من خلال كسور وشطف باستخدام قارئ microplate مضان.
- العلاقة الخطية بين كمية الدهون الحويصلي وكثافة مضان الحويصلة متجهة Vybrant CM - الجاذبة يتم التحقق من الكمية التي اللوني رقيقة الطبقة العالية الأداء (HPTLC) من خليط الدهن تطبيقها على أساس MACS V - Annexin.
- يتم التحقق من نوعية رد الفعل ملزم للبروتينات aPKC أو غيرها إلى الحويصلات سيراميد / فسفاتيديل قبل مقايسة الأضداد المنافسة باستخدام 1 ميكروغرام المضادة للأجسام المضادة PKCζ الأرنب النسائل المتعددة لاحتضان هذه الخلية لlysate ح 1 في 4 درجات مئوية قبل الحضانة مع وحويصلات الدهنية.
- ويتم تحليل هذا البروتين ملزمة لسيراميد / فسفاتيديل الحويصلات في شطافة MACS بواسطة SDS - PAGE وimmunoblotting.
في المختبر معقدة البروتين الدهني قطبية
- يتم تنفيذ إعادة المختبر في مجمع الاقطاب البروتين الدهني باتباع الإجراء LIMACS كما هو موضح في المقطع السابق. في فسفاتيديل وجيزة (420 ميكروغرام) و C16 - سيراميد (107 ميكروغرام) يجفف من المذيبات العضوية.
- ومعلق في الدهون تحت صوتنة المجفف في 500 ميكرولتر من حويصلة العازلة (50 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5 ؛ 150 مم كلوريد الصوديوم).
- يضاف خمسة ميكرولتر من 10 ملي MnCl2 ، 1 ميكرولتر من Vybrant الجاذبة - CM ، و 500 نانوغرام من PKCζ (المؤتلف الإنسان) وخليط التفاعل المحتضنة undergentle الانفعالات لمدة 60 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- يتم استرداد CM - الجاذبة ملطخة Vybrant فسفاتيديل / سيراميد حويصلات بواسطة الطرد المركزي في 12000 XG لمدة 60 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- هو معلق على بيليه (الوردي) في 100 تريس العازلة ميكرولتر وتستكمل مع γS - GTP (100 ميكرومتر) ، الناتج المحلي الإجمالي (1 ملم) ، وضريبة السلع والخدمات ، Par6 (100 نانوغرام) ، أو ضريبة السلع والخدمات ، Cdc42 (500 نانوغرام) وكذلك حضنت لمدة 3 ح في 4 درجات مئوية (يمكن استخدام أي تركيبة أخرى من البروتينات المؤتلف من الاهتمام هنا).
- Annexin V - العازلة (5 ميكرولتر من محلول المخزون 20X) ، وAnnexin V - مترافق الخرز المغناطيسي (50 ميكرولتر) وتضاف إلى خليط التفاعل في إطار التحريض المحتضنة لطيف لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- يتم تنفيذ Annexin V - MACS بعد بروتوكول المورد كما هو موضح سابقا. وتستكمل الكسر شطف (1 مل) مع 10 ميكروغرام من ovalbumin نقية كمعونة هطول الأمطار. ويتركز هذا البروتين التي يسيل - Flugge هطول الأمطار وتحليلها بواسطة SDS-PAGE/immunoblotting كما هو موضح سابقا 8.
- كميا هو كمية الدهون eluted الحويصلات التي كشف Vybrant الجاذبة - CM (الوردي) في المرحلة (كلوروفورم / الميثانول) العضوي للتفاعل Flugge الأمطار يسيل. هو تطبيع كمية البروتين في تحليل كميات متساوية من حويصلات الدهنية.
3. النتائج
LIMACS تنقية EGFP - PKCζ والمجال سيراميد ملزمة C20ζ - EGFP
A lysate المنظفات الخالية من الخلايا MDCK معربا عن كامل طول PKCζ C - عضال مرتبطة بروتين الفلورية الخضراء (FLζ - EGFP) أو مجال سيراميد ملزمة في النهاية من PKCζ - C (EGFP - C20ζ) وحضنت مع فسفاتيديل / الحويصلات كما سيراميد ووصف في الإجراءات التجريبية. بعد شطف من العمود MACS ، تم تحليل البروتينات والأجسام المضادة باستخدام immunoblotting ضد PKCζ وEGFP للكشف عن البروتين eluted 2.
الشكل 1. LIMACS من EGFP المسمى PKCζ والخمسين من طراز C - المحطة باستخدام جزء C20ζ فسفاتيديل / سيراميد الحويصلات.
وحضنت المنظفات الخالية من الخلايا lysates MDCK معربا عن EGFP (كعنصر تحكم غير ملزمة) ، كامل طول PKCζ - EGFP ، أو الربط سيراميد ، C - المحطة جزء C20ζ - EGFP مع فسفاتيديل / حويصلات سيراميد كما هو موضح في المقطع الإجراءات التجريبية . بعد استخدام LIMACS ، كان eluted البروتين العازلة مع عينة وتحليلها بواسطة SDS SDS - PAGE وimmunoblotting. اللوحة اليسرى يدل على أن لا ربط EGFP إلى الحويصلات مع الاحتفاظ حبات V - مرتبطة Annexin المغناطيسي. لوحة المتوسطة وتبين أن الحق الكامل طول PKCζ - EGFP واستبقيت C20ζ - EGFP بسبب ملزمة لسيراميد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لاختبار مدى التفاعل بين محددة الدهون والبروتين ملزمة تعوقها تضمين الدهون في غشاء الخلية. غشاء الخلية يتكون من خليط من عدة الدهون والبروتينات ويتم تنظيمه في microdomains الدهون أو الطوافات. لذلك ، يمكن المشارك تنقية microdomains والبروتينات لا يميز بوضوح ما إذا كان بروتين يرتبط مباشرة إلى الدهون أو المخصب فقط في بنية microdomain. ويمكن استخدام طرق أخرى محددة الدهون على الأسطح المطلية مثل ELISAs الدهون أو مأكل مثل الطحين الطيفي بالرنين كشف التفاعل من الدهون مع البروتين محددة ملزمة لها.. ومع ذلك ، لتحديد هذا التفاعل في بيئة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية الغشاء ، والسطح (على سبيل المثال ، عن التحليل الطيفي بالرنين مأكل مثل الطحين) يجب أن تكون مغلفة مع حويصلات الدهنية أو الليبوزومات.
طورنا حويصلة الدهون مقايسة رواية ملزمة كبديل لهذه الأساليب السابقة. الجدة تأتي من الدهون ادراج شركة مرساة (فسفاتيديل) في الحويصلات ، والذي يسمح لعزل الحويصلات الدهون مع حبات V - مترافق Annexin المغناطيسي. ولذلك ، ووصف لنا هذا الاختبار اللوني الدهون تقارب حويصلة بوساطة استخدام الفرز المغناطيسي تنشيط الخلية (LIMACS). وأعرب تشكيل البروتينات في الخلايا ، أو البروتينات المؤتلف لا يمكن أن يؤديها LIMACS الذاتية للبروتينات ، في الدهن بروتين معقد 1-3.
ثم يمكن للبروتين منضمة إلى حويصلات الدهنية يمكن استردادها عن طريق اتخاذ ببساطة العمود MACS من الوقوف المغناطيسية ويبلغ حجمه فإنه مع وجود مخزن مؤقت المناسبة. وهذا يمكن أن تكون متوافقة العازلة انزيم لقياس نشاط انزيم في شطافة أو SDS العازلة لإجراء تحليل عينة بروتين باستخدام SDS - PAGE وimmunoblotting. إذا باستخدام SDS العازلة عينة العمود MACS لا بد من إزالتها من الوقوف المغناطيسي ، مما يسمح للاحتفاظ بها من الخرز المغناطيسي على الوقوف.
هناك بعض الاحتياطات التي يجب اتخاذها عند استخدام LIMACS. من الواضح ، لا يمكن أن تستخدم LIMACS مع lysate المنظفات لأن هذا سوف يدمر حويصلات الدهنية. أيضا ، لا بد من اختبار ما إذا كان البروتين الدهني الملزمة للهدف ملزم أيضا إلى فسفاتيديل بسبب استخدام هذه الدهون باعتباره مرتكزا للالملزم للحويصلات لحبات V - مترافق Annexin المغناطيسي. . في بعض الحالات ، قد يضعف فسفاتيديل ملزما للبروتين الهدف. لذلك ، وضوابط الرقابة السلبية مع كميات مختلفة من فسفاتيديل أن تدرج في مقايسة. ويمكن تنفيذ Thesecontrols بسهولة باستخدام الحويصلات التي تحتوي على الدهون فسفاتيديل فقط أو مزيج من فسفاتيديل مع الدهون غير ملزم. مطلوب أيضا ضوابط السلبية بما في ذلك lysates الخلية التي تحتوي على كمية كبيرة من فسفاتيديل الذاتية. لتجنب التلوث مع الأغشية الدهون الذاتية أو حويصلات فمن المستحسن لمسح lysate الخلية بما في ذلك خطوة في تنبيذ فائق 100000 XG ل 1 ساعة. فمن الواضح أن البروتينات ملزمة الدهون في طاف لا يمكن إلا أن عصاري خلوي ، وهو وجود قيود على إجراء LIMACS. هناك إمكانية لتمديد LIMACS إلى الدهون مرساة أخرى مثل الكوليرا وGM1 الوحيدات ب السم مترافق مع الخرز المغناطيسي.
نحن نبحث حاليا استخدام الدهون محددة الأجسام المضادة للLIMACS ، الأمر الذي سيجعل من استخدام الدهون مرساة لإعداد الحويصلات لا لزوم لها. أحد الجوانب المفيدة للLIMACS هو عزل الدهن بروتين معقد والذي يسمح لمجموعة متنوعة من الأساليب التحليلية التي يتم بروتين غير قابل للتطبيق.. على سبيل المثال ، استخدمنا LIMACS لعزل بروتين معقد من الاستقطاب المعاد Par6/Cdc42 المرتبطة سيراميد aPKC محدد. لذلك ، LIMACS هو أسلوب الرواية القوية للتحليل والعزلة البروتين الدهني المجمعات المرتبطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة وR01NS046835 R01AG034389 ، ومارس من منحة الدايمات 6FY08 - 322. شكر خاص مكرس لك السيدة اليانور براون (Miltenyi بيوتيك ، صحراء ، كاليفورنيا) الذي ساعد بشكل كبير على بصيرة لها في MACS التكنولوجيا. وقد قدمت بسخاء Miltenyi المواد المستخدمة للمظاهرة من التجارب في أي تكلفة. كما أنني ممتن للدكتور جوانجهو وانغ (كلية الطب في جورجيا / جامعة جورجيا العلوم الصحية ، أوغوستا ، GA) الذي ولدت PKCζ معربا عن خطوط الخلايا. ومن المسلم به أيضا دعم من قبل معهد الطب الجزيئي في كلية الطب في جورجيا / جامعة جورجيا للعلوم الصحية (في إطار الاتجاه من الدكتور لين مى).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns | Miltenyi Biotec | ||
| Lipids (of highest purity) | Avanti Polar Lipid, Inc |
References
- Wang, G. Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells. J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).
- Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells. J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).
- Chalfant, C. E. De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1. J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).
- Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles. Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).
- Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. Biophysics (and sociology) of ceramides. Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).
- Kumagai, K. CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides. J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).
