Summary
Para probar la interacción de una proteína con su objetivo de lípidos se utilizó MACS y anexina V conjugada con partículas magnéticas y de las vesículas de lípidos sintetizados a partir de los lípidos de destino y fosfatidilserina anexina V vinculante. Proteínas unidas a los lípidos de destino se co-purificados y analizados después de la elución de las cuentas.
Abstract
El análisis de la interacción lípido proteína es difícil debido a los lípidos están incrustados en las membranas celulares y, por tanto, inaccesible para la mayoría de los procedimientos de purificación. Como alternativa, los lípidos pueden estar recubiertas por superficies planas que se utilizan para lípidos ELISA y resonancia de plasmones de la espectroscopia. Sin embargo, los lípidos de la superficie de revestimiento no forman microdominios estructuras, que pueden ser importantes para las propiedades de unión de lípidos. Además, estos métodos no permiten la purificación de grandes cantidades de proteínas de unión a los lípidos de su objetivo.
Para superar estas limitaciones de las pruebas de interacción de proteínas y lípidos para purificar las proteínas de unión de lípidos, hemos desarrollado un nuevo método denominado vesícula lipídica mediada por cromatografía de afinidad utilizando magnético activado por la selección de células (LIMACS). En este método, las vesículas de lípidos son preparados con el objetivo de lípidos y la fosfatidilserina como los lípidos de anclaje para anexina V MACS. Fosfatidilserina es un fosfolípido de la membrana celular omnipresente que muestra una alta afinidad a la proteína anexina V. Con perlas magnéticas conjugadas con anexina V de las vesículas de lípidos que contienen fosfatidilserina se unen a las bolas magnéticas. Cuando las vesículas lipídicas se incuban con un lisado celular de la proteína de unión a los lípidos objetivo también tendrá la obligación de las cuentas y puede ser co-purificado utilizando MACS. Este método también se puede utilizar para comprobar si las proteínas recombinantes reconstruir un complejo de proteínas de unión a los lípidos de destino.
Hemos utilizado este método para mostrar la interacción de la PKC atípicas (aPKC) con la ceramida esfingolípidos y co-purificar respuesta apoptosis de próstata 4 (PAR-4), una proteína de unión a la ceramida asociada aPKC. También hemos utilizado este método para la reconstitución de un complejo de ceramidas asociados de aPKC recombinante con la célula relacionados con la polaridad de las proteínas PAR6 y Cdc42. Desde las vesículas de lípidos pueden ser preparados con una variedad de sphingo o fosfolípidos, LIMACS ofrece una prueba versátil para la interacción lípido-proteína en un ambiente de lípidos que se parece mucho a la de la membrana celular. Otros complejos de lípidos y proteínas pueden ser identificadas mediante análisis de proteómica de proteínas de unión de lípidos co-purifica con las vesículas lipídicas.
Protocol
1. Introducción
Los lípidos de vesículas mediada por cromatografía de afinidad utilizando magnético activado por la selección de células (LIMACS) técnica fue desarrollada en nuestro laboratorio para aislar la ceramida asociada a complejos de proteínas 1.3. Originalmente, las vesículas lipídicas se hicieron de la ceramida y la fosfatidilserina, lo que permitió el uso de partículas magnéticas MACS-anexina V conjugada (muy afín a la fosfatidilserina) para aislar las vesículas y sus proteínas asociadas. Hemos utilizado la técnica de LIMACS para la reconstitución in vitro de un complejo de ceramidas polaridad asociada y el aislamiento de la ceramida proteínas de unión a partir de lisados celulares 3. LIMACS se puede modificar mediante otros socios de interacción para el aislamiento de las vesículas (por ejemplo, glicolípidos-specifc lectinas y anticuerpos de lípidos).
2. Los procedimientos experimentales
Preparación de vesículas de lípidos y Ensayos aPKCBinding
- Vesículas de lípidos se obtienen a partir de mezclas secas de cantidades equimolares de fosfatidilserina (105 mg) y C16-ceramida (85 mg) después de procedimientos modificados para la preparación de liposomas grandes 1,4-7.
- Las mezclas de lípidos después se volvieron a suspender y se sonica durante 1 h en 100 l de tampón de vesículas que consta de 50 mM Tris / HCl (pH 7,5) y 150 mM NaCl.
- Después de la adición de 300 l de tampón vesícula suplementado con 0,1 mM de MnCl2, las muestras se centrifugan a 12.000 g μ por 20 min a 4 ° C.
- El pellet (vesículas grandes lípidos) se resuspende en 100 l de buffer de la vesícula y se incubaron con 1 nmol de Vybrant CM-dii durante 1 hora a 37 ° C para visualizar la fracción de vesículas después de la separación MACS. Vybrant CM-dii es un tinte rojo fluorescente específicamente incorporar en las membranas lipídicas.
- Un detergente libre de lisado celular se prepara por ultrasonidos / homogeneización de las células en 300 l de tampón hipotónico (10 mM Tris / HCl (pH 7.0) con la proteasa y los inhibidores de la fosfatasa) seguido de la eliminación de los desechos membranosa por centrifugación. Un paso de centrifugación a 100.000 xg durante 1 h, debe añadirse a evitar la contaminación del lisado celular con membranas endógeno que contiene fosfatidilserina.
- El lisado aclarado se añade a la suspensión de vesículas de lípidos, y la mezcla se incuba durante 2 horas a 4 ° C.
- La mezcla de reacción se complementa con 20 l de buffer 20x anexina V vinculante y 50 l de una solución que contiene partículas magnéticas conjugadas con anexina V seguido de la incubación durante 1 hora a 4 ° C.
- MACS se realiza de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Inc.) de protocolo. La presencia y la cantidad de vesículas de lípidos está determinada por el control de la Vybrant CM-dii de fluorescencia en las fracciones a través del flujo y elución utilizando un lector de microplacas de fluorescencia.
- La correlación lineal entre la cantidad de lípidos vesicular y la intensidad de fluorescencia de la vesícula con destino Vybrant CM-dii es verificada por cuantitativos de alto rendimiento cromatografía en capa fina (HPTLC) de la mezcla de lípidos se aplica a la anexina V-Macs.
- La especificidad de la reacción de unión de proteínas aPKC u otras a las vesículas ceramida / fosfatidilserina es verificada por un ensayo de competición de anticuerpos por medio de 1 mg de anti-PKCζ anticuerpo policlonal de conejo para la incubación del lisado celular durante 1 hora a 4 ° C antes de la incubación con los lípidos vesículas.
- La proteína de unión a vesículas ceramida / fosfatidilserina en el eluido MACS se analizaron por SDS-PAGE e inmunoblotting.
En el complejo de la polaridad de los lípidos in vitro de proteínas
- La reconstitución in vitro de un complejo lípido-proteína de la polaridad se realiza siguiendo el procedimiento LIMACS como se describe en la sección anterior. En breve fosfatidilserina, (420 mg) y C16-ceramida (107 mg), se seca a partir de un disolvente orgánico.
- Los lípidos secos se volvieron a suspender en tratamiento con ultrasonidos en 500 l de buffer de vesícula (50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl).
- Cinco l de 10 mM MnCl2, 1 l de Vybrant CM-DII, y 500 ng de PKCζ (recombinante humana) se añade la mezcla de reacción se incubó undergentle agitación durante 60 min a 4 ° C.
- Vybrant CM-dii manchada fosfatidilserina / ceramida vesículas se recuperó por centrifugación a 12.000 xg durante 60 min a 4 ° C.
- El pellet (rosa) se resuspende en 100 l de tampón Tris y se complementa con γS-GTP (100 M), el PIB (1 mM), GST-PAR6 (100 ng), o GST-Cdc42 (500 ng) y se incubaron durante 3 horas a 4 ° C (cualquier otra combinación de proteínas recombinantes de interés puede ser utilizado aquí).
- Anexina V-buffer (5 l de una solución madre 20 veces) y anexina V conjugada con partículas magnéticas (50 l) se añadió la mezcla de reacción se incubaron en agitación suave durante 30 min a 4 ° C.
- Anexina V-MACS se realiza siguiendo el protocolo del proveedor como se describió anteriormente. La fracción de elución (1 ml) se complementa con 10 mg de albúmina de huevo pura como la ayuda de precipitación. La proteína se concentra por Wessel-Flugge precipitación y analizados por SDS-PAGE/immunoblotting como se describió previamente 8.
- La cantidad de vesículas de lípidos eluidos se cuantifica mediante la detección de Vybrant CM-DII (rosa) en los orgánicos (cloroformo / metanol) fase de la reacción de precipitación Wessel Flugge. La cantidad de proteína analizada se normaliza en la misma cantidad de vesículas de lípidos.
3. Resultados
LIMACS purificación de PKCζ-EGFP y el dominio de unión de la ceramida C20ζ-EGFP
Un lisado con detergente libre de células MDCK expresar toda su longitud PKCζ C-terminal ligada a la proteína verde fluorescente (EGFP FLζ-) o un dominio de unión de la ceramida en el C-terminal de PKCζ (C20ζ-EGFP) se incubó con fosfatidilserina / vesículas ceramida como se describe en los procedimientos experimentales. Tras la elución de la columna de MACS, la proteína se analizó mediante inmunotransferencia y anticuerpos contra PKCζ y EGFP para la detección de la proteína eluye 2.
Figura 1. LIMACS de EGFP-etiquetados PKCζ y su C-terminal del fragmento C20ζ utilizando fosfatidilserina / ceramida vesículas.
Detergente libre de lisados de células MDCK que expresan EGFP (como control no vinculante), la longitud total PKCζ-EGFP, o la unión de la ceramida, C-terminal del fragmento C20ζ-EGFP se incubaron con fosfatidilserina / vesículas ceramida como se describe en la sección de Procedimientos experimentales . Después de usar LIMACS, la proteína se eluyó con tampón de muestra SDS y se analizaron por SDS-PAGE e inmunoblotting. El panel izquierdo muestra que EGFP no se unen a las vesículas mantenido con la anexina V-vinculados partículas magnéticas. El panel del medio y la derecha muestra que la longitud total PKCζ-EGFP y C20ζ-EGFP fueron retenidos debido a la unión a la ceramida.
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Discussion
Para probar la interacción específica entre un lípido y su unión a proteínas se ve obstaculizada por la incrustación de los lípidos de la membrana celular. La membrana celular consiste en una mezcla de lípidos y proteínas de varios y se organiza en microdominios lipídicos o balsas. Por lo tanto, la co-purificación de microdominios y las proteínas no se pueden distinguir claramente si una proteína se une directamente a un lípido o sólo se enriquece en una estructura de microdominios. Otros métodos que utilizan los lípidos se define en las superficies de revestimiento, tales como ELISA lípidos o la espectroscopia de resonancia de plasmones puede detectar la interacción de un lípido específico con su unión a proteínas .. Sin embargo, para determinar esta interacción en un entorno de membrana fisiológicamente relevantes, la superficie (por ejemplo, para la espectroscopia de resonancia de plasmones) tiene que ser cubierto con vesículas de lípidos o liposomas.
Hemos desarrollado un nuevo ensayo de lípidos de vesículas de unión como una alternativa a los métodos anteriores. La novedad viene de la incorporación de un ancla de lípidos (fosfatidilserina) en las vesículas, lo que permite el aislamiento de las vesículas de lípidos con anexina V conjugada con partículas magnéticas. Por lo tanto, este lípido denominado ensayo de vesículas mediada por cromatografía de afinidad utilizando clasificación magnética de células activadas (LIMACS). LIMACS se puede realizar de las proteínas endógenas, proteínas que se expresan en las células o proteínas recombinantes se reconstituye en un complejo de lípidos y proteínas 1.3.
La proteína unida a las vesículas lipídicas se pueden recuperar simplemente tomando la columna MACS del soporte magnético y eluyendo con un tampón apropiado. Esto puede ser un tampón de enzima compatible para medir la actividad enzimática en el efluente o tampón SDS muestra para realizar el análisis de proteínas mediante SDS-PAGE e inmunoblotting. Si se utiliza tampón SDS muestra de la columna MACS no tiene que ser retirado del soporte magnético que permite la retención de las partículas magnéticas en el stand.
Hay precauciones que deben tomarse cuando se utiliza LIMACS. Evidentemente, LIMACS no se puede utilizar con un lisado de detergente, ya que esto destruye las vesículas lipídicas. Además, tiene que ser probado si la proteína de unión de los lípidos de destino también se une a la fosfatidilserina, porque este lípido se utiliza como un ancla para la unión de las vesículas de anexina V conjugada con partículas magnéticas. . En algunos casos, la fosfatidilserina puede afectar la unión a la proteína diana. Por lo tanto, los controles negativos y controles con diferentes cantidades de fosfatidilserina tienen que ser incluidos en el ensayo. Thesecontrols se puede realizar fácilmente mediante el uso de las vesículas de lípidos que contiene sólo fosfatidilserina o una mezcla de fosfatidilserina no vinculantes lípidos. Incluyendo los controles negativos también es necesario para lisados de células que contienen una cantidad significativa de fosfatidilserina endógeno. Para evitar la contaminación con las membranas de lípidos endógenos o vesículas que se recomienda borrar el lisado celular mediante la inclusión de un paso ultracentrifugación a 100.000 xg durante 1 h. Es evidente que las proteínas de unión de lípidos en el sobrenadante sólo puede ser citosólica, que es una limitación del procedimiento LIMACS. Existe la posibilidad de ampliar LIMACS a los lípidos de anclaje tales como GM1 y la toxina del cólera subunidad B conjugado con partículas magnéticas.
Actualmente estamos estudiando el uso de los lípidos de anticuerpos específicos para LIMACS, lo que haría el uso de los lípidos de anclaje para la preparación de las vesículas innecesarios. Uno de los aspectos beneficiosos de la LIMACS es el aislamiento del complejo de lípidos y proteínas lo que permite una variedad de métodos de análisis de proteínas que no son aplicables .. Por ejemplo, hemos utilizado LIMACS para aislar a un complejo de proteína reconstituida polaridad de Par6/Cdc42 asociados con ceramida obligado aPKC. Por lo tanto, LIMACS es un método novedoso de gran alcance para el análisis y el aislamiento de los complejos de lípidos y proteínas asociadas.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH y R01NS046835 R01AG034389, y la March of Dimes conceder 6FY08-322. Un agradecimiento especial se dedica a la Sra. Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), que ayudó enormemente con su visión de la tecnología MACS. Miltenyi ha ofrecido generosamente el material utilizado para la demostración de los experimentos, sin costo alguno. También estoy agradecida con el Dr. Wang Guanghu (Medical College of Georgia / Georgia Universidad Ciencias de la Salud, Augusta, GA), que generó la PKCζ líneas celulares que expresan. Apoyo del Instituto de Medicina Molecular de la Facultad de Medicina de Georgia / Ciencias de la Salud de la Universidad de Georgia (bajo dirección del Dr. Lin Mei) también se reconoce.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns | Miltenyi Biotec | ||
| Lipids (of highest purity) | Avanti Polar Lipid, Inc |
References
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