Summary
Для проверки взаимодействия белка с его целевым липидного мы использовали MACS и Аннексин V-сопряженных магнитных гранул и липидных везикул синтезируется из липидных цели и Аннексин V-связывающих фосфатидилсерина. Белки связаны с целевой липидного совместно очищенный и проанализированы после элюирования из бисера.
Abstract
Анализ липидного взаимодействия белка трудно, потому что липиды встраиваются в клеточные мембраны и, следовательно, недоступными для большинства процедур очистки. В качестве альтернативы, липиды могут быть покрыты на плоских поверхностях, который используется для липидного ИФА и Plasmon резонансной спектроскопии. Тем не менее, липидов поверхности покрытия не образуют микродоменной структуры, которые могут иметь важное значение для липидного связующие свойства. Кроме того, эти методы не позволяют для очистки больших количеств белков привязки к их липидов цели.
Чтобы преодолеть эти ограничения тестирования взаимодействия липидных белка и очистить липидного связывающих белков, мы разработали новый метод называют липидные пузырьки-опосредованной аффинной хроматографии с использованием магнитных активированных сортировки клеток (LIMACS). В этом методе, липидные пузырьки готовы с целевой липидного и фосфатидилсерина, как якорь для липидного Аннексин V MACS. Фосфатидилсерин является вездесущий фосфолипид клеточных мембран, который показывает высокое сродство к Аннексин белка В. Использование магнитных шариков конъюгированных с Аннексин V фосфатидилсерина содержащих пузырьки липидного будет связываться с магнитных бус. Когда липидные пузырьки инкубируют с Клеточный лизат связывание белка с целевой липидного также будет связан с бисером и могут быть совместно очищают, используя MACS. Этот метод может также использоваться для проверки, если рекомбинантных белков восстановить белковый комплекс привязки к целевой липидов.
Мы использовали этот метод, чтобы показать взаимодействие атипичной PKC (aPKC) с сфинголипида церамида и сотрудничать очистить простаты апоптоз ответ 4 (PAR-4), связывание белка с церамида связанных aPKC. Мы также использовали этот метод для воссоздания церамида связанных комплекс рекомбинантного aPKC с клеточной полярности связанных белков Par6 и Cdc42. С липидные пузырьки могут быть подготовлены с различными sphingo или фосфолипиды, LIMACS предлагает универсальный тест на липид-белковых взаимодействий в липидных среды, которая напоминает, что тесно клеточной мембраны. Дополнительная белковых комплексов липид можно получить, используя протеомики анализ липидного связывающий белок совместно с очищенной липидных везикул.
Protocol
1. Введение
Липидных везикул-опосредованной аффинной хроматографии с использованием магнитных активированной сортировки клеток (LIMACS) техника была разработана в нашей лаборатории, чтобы изолировать церамида связанных белковых комплексов 1-3. Изначально липидные пузырьки были сделаны из керамидов и фосфатидилсерина, что позволило MACS с использованием магнитных частиц, конъюгированных Аннексин V (высоко аффинных к фосфатидилсерина), чтобы изолировать пузырьки и связанных с ними белков. Мы использовали технику для LIMACS в пробирке восстановление церамида связанных комплекс полярности и изоляции церамида-связывающих белков из клеточных лизатов 3. LIMACS можно изменить с помощью других партнеров по взаимодействию для выделения пузырьков (например, гликолипидов-лектины, специфические или липидных антител).
2. Экспериментальные процедуры
Подготовка липидные пузырьки и aPKCBinding Анализы
- Липидные пузырьки получаются из сушеных смесей эквимолярных количеств фосфатидилсерина (105 мкг) и C16-церамида (85 мкг) следующие изменение процедуры для крупных липосом подготовки 1,4-7.
- Липидных смесей, которые затем ресуспендировали и обрабатывали ультразвуком в течение 1 ч в 100 мкл буфера пузырь, состоящий из 50 мМ Tris / HCl (рН 7,5) и 150 мМ NaCl.
- После добавления 300 мкл буфера пузырьков дополнена 0,1 ммоль MnCl 2, образцы центрифугировали при 12 000 μ г в течение 20 мин при 4 ° C.
- Гранул (крупные пузырьки липидов) ресуспендируют в 100 мкл буфера пузырьков и инкубировали с 1 нмоль Vybrant CM-DII в течение 1 ч при 37 ° С для визуализации пузырьков фракция после разделения MACS. Vybrant CM-DII является красный флуоресцентный краситель в частности о включении в липидных мембранах.
- Моющего средства без лизата клетка готовится с помощью ультразвука / гомогенизации клеток в 300 мкл буфера гипотонический (10 мМ Tris / HCl (рН 7,0) с протеазы и ингибиторы фосфатазы) с последующим удалением мембранных мусора с помощью центрифугирования. Центрифугирования шаг 100000 мкг в течение 1 ч должны быть добавлены, чтобы избежать загрязнения Клеточный лизат с эндогенными мембран содержащих фосфатидилсерина.
- Очищается лизат добавляют к суспензии везикул липидов, и смесь выдерживают в течение 2 ч при 4 ° C.
- Реакционную смесь дополнена с 20 мкл 20x Аннексин V обязательным буфера и 50 мкл раствора, содержащего магнитных шариков конъюгированных с Аннексин V с последующей инкубацией в течение 1 ч при 4 ° C.
- MACS осуществляется в соответствии с завода-изготовителя (Miltenyi Biotec, Inc) протоколу. Наличие и количество липидных везикул определяется мониторинга Vybrant CM-DII флуоресценции в проточных и элюирования фракции с использованием микропланшетного флуоресценции.
- Линейная корреляция между количеством везикулярного липидов и интенсивности флуоресценции пузырьков связанного Vybrant CM-DII подтверждается количественным высокопроизводительных тонкослойной хроматографии (HPTLC) липидной смеси применяются к Аннексин В основе MACS.
- Специфичность связывания реакция aPKC или других белков церамида / фосфатидилсерина пузырьки проверяется анализ антител конкуренции с использованием 1 мкг анти-PKCζ кролик поликлональных антител для инкубации Клеточный лизат в течение 1 ч при 4 ° С до инкубации с липидных везикул.
- Связывание белка с церамида / фосфатидилсерина пузырьки в элюата MACS анализируется SDS-PAGE и иммуноблоттинга.
В пробирке липид-белковых комплекса полярности
- В пробирке восстановление липид-белковых полярность комплекса осуществляется в соответствии с процедурой LIMACS, как описано в предыдущем разделе. Короче говоря, фосфатидилсерина (420 мкг) и C16-церамида (107 мкг) сушат с органическим растворителем.
- Сушеных липиды ресуспендировали под ультразвуком в 500 мкл пузырьков буфера (50 мМ Tris / HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl).
- Пять мкл 10 мМ MnCl2, 1 мкл Vybrant CM-DII и 500 нг PKCζ (человеческий рекомбинантный) добавляется и реакционную смесь инкубировали undergentle агитации в течение 60 мин при 4 ° C.
- Vybrant CM-DII окрашенных фосфатидилсерина / церамида пузырьки могут быть восстановлены с помощью центрифугирования при 12000 мкг в течение 60 мин при 4 ° C.
- Гранул (розовый) ресуспендируют в 100 мкл буфера Трис и дополнены γS-ГТП (100 мкМ), ВВП (1 мМ), GST-Par6 (100 нг), или GST-Cdc42 (500 нг) и далее инкубировали в течение 3 ч при 4 ° C (любой другой комбинации рекомбинантных белков интересов могут быть использованы здесь).
- Аннексин V-буфер (5 мкл 20x маточного раствора) и Аннексин V-сопряженных магнитных шариков (50 мкл) добавляют, и реакционную смесь инкубировали при легком помешивании в течение еще 30 мин при 4 ° C.
- Аннексин V-MACS осуществляется следующим протоколом поставщика как описано выше. Элюирования дробь (1 мл) с добавлением 10 мкг чистого овальбумина в виде осадков помощи. Белок концентрируется Вессель-Флюгге осадков и проанализированы SDS-PAGE/immunoblotting, как описано выше 8.
- Количество элюировали пузырьки липидов количественно обнаружение Vybrant CM-DII (розовый) в органической (хлороформ / метанол) фаза реакции преципитации Вессель Флюгге. Количество белка проанализированы нормированная на равное количество липидных везикул.
3. Результаты
LIMACS очистки PKCζ-EGFP и церамида связывающий домен C20ζ-EGFP
Моющего средства без лизата MDCK клеток, экспрессирующих всей длине PKCζ C-неизлечимо связаны с зеленого флуоресцентного белка (FLζ-EGFP) или церамида связывающий домен в С-конце PKCζ (C20ζ-EGFP) инкубировали с фосфатидилсерина / церамида пузырьки, как описанные в экспериментальной процедуры. После элюирования колонки MACS, белков анализировали с помощью иммуноблоттинга и антител против PKCζ и EGFP для обнаружения элюировали белок 2.
Рисунок 1. LIMACS из EGFP меченных PKCζ и его С-концевой фрагмент C20ζ использованием фосфатидилсерина / церамида пузырьков.
Моющие средства без лизатах MDCK клеток, экспрессирующих EGFP (как необязательные контроля), полная длина PKCζ-EGFP, или керамиды обязательными, С-концевой фрагмент C20ζ-EGFP инкубировали с фосфатидилсерина / церамида пузырьки, как описано в разделе экспериментальных процедур . После использования LIMACS, белок элюировали буфером образец SDS и анализируют SDS-PAGE и иммуноблоттинга. Левая панель показывает, что EGFP не связываться с пузырьками сохраняется с Аннексин V-связанных магнитных бус. Средняя и правая панель показывает, что полная длина PKCζ-EGFP и C20ζ-EGFP были сохранены из-за привязки к керамиды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для проверки конкретного взаимодействия между липидной и его связывания с белками препятствуют вложению липидов в клеточной мембране. Клеточная мембрана состоит из смеси нескольких липидов и белков, и организованная в липидных микродоменов или плотах. Таким образом, совместное очистки микродоменов и белки, не может четко отличить, если белок непосредственно связывается с липидной или только обогащенный микродоменной структуры. Другие методы, использующие определенный липидов покрытием на поверхностях, таких как липидные ИФА или Plasmon резонансной спектроскопии можно обнаружить взаимодействие конкретных липидного с его связывания с белками .. Однако, чтобы определить это взаимодействие в физиологически соответствующих мембраны окружающей среды, поверхность (например, для Plasmon резонансной спектроскопии) должна быть покрыта липидные пузырьки или липосомы.
Мы разработали новый пузырь липидного анализа связывания в качестве альтернативы этим предыдущих методов. Новизна приходит от включения якоря липидов (фосфатидилсерина) в пузырьки, что позволяет изоляцию липидных везикул с Аннексин V-сопряженных магнитных бус. Поэтому мы назвали этого анализа липидных везикул-опосредованной аффинной хроматографии с использованием магнитных активированный сортировки ячейки (LIMACS). LIMACS может быть выполнена для эндогенных белков, белки экспрессируются в клетках, или рекомбинантных белков воссоздана в белковый комплекс липидного 1-3.
Белок связан с липидные пузырьки могут быть восстановлены, просто беря MACS столбец из магнитных стоять и элюирования его с соответствующим буфером. Это может быть ферментом совместимы буфера для измерения активности фермента в элюата или SDS образец буфера для выполнения анализа с использованием белков SDS-PAGE и иммуноблоттинга. При использовании SDS образец буфера MACS столбец не должны быть удалены от магнитного стенд, который позволяет сохранение магнитных шариков на стенде.
Существуют меры предосторожности при использовании LIMACS. Очевидно, что LIMACS не может быть использована с моющим средством лизат, потому что это разрушит липидных везикул. Кроме того, она должна быть проверена, если связывающий белок целевой липидного также связывается с фосфатидилсерина, потому что это липидные используется как якорь для связывания пузырьки на Аннексин V-сопряженных магнитных бус. . В некоторых случаях, фосфатидилсерина может привести к нарушению связывания с белком-мишенью. Таким образом, отрицательные контроля и управления с различными количествами фосфатидилсерина должны быть включены в анализ. Thesecontrols может быть легко выполнен с помощью липидных везикул, содержащих только фосфатидилсерина или смесь фосфатидилсерина с необязательными липидов. В том числе отрицательный контроль также необходим для клеточных лизатов, которые содержат значительное количество эндогенной фосфатидилсерина. Во избежание загрязнения с эндогенными липидных мембран или пузырьки, то рекомендуется, чтобы очистить Клеточный лизат, включив ультрацентрифугирования шаг 100000 мкг в течение 1 ч. Очевидно, что липидные связывающих белков в супернатант может быть только цитозольного, который является ограничение процедуры LIMACS. Существует возможность расширения LIMACS других липидов якорь, таких как GM1 и холерного токсина B субъединицы сопряженных с магнитной бусины.
Мы в настоящее время изучает возможность использования липид-специфических антител для LIMACS, что сделает использование якоря липидов для подготовки пузырьки ненужным. Один из полезных аспектов LIMACS является изоляция сложный липидный белок, который позволяет применять самые разнообразные белка аналитических методов, которые не являются реализуемыми .. Например, мы использовали LIMACS выделить восстановленные белковый комплекс полярность Par6/Cdc42 связанные с церамида связанного aPKC. Таким образом, LIMACS является мощным методом роман для анализа и изоляции липид-ассоциированных комплексов белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH R01NS046835 и R01AG034389 и марте Dimes грант 6FY08-322. Отдельное спасибо посвящена г-жа Элеонора Браун (Miltenyi Biotec, Оберн, штат Калифорния), который очень помогло с ней понимание технологии MACS. Miltenyi щедро предоставили материал, используемый для демонстрации экспериментов на безвозмездной основе. Я также благодарен доктору Guanghu Ванг (Медицинский колледж Джорджии / Грузия медицинских наук университета, Augusta, GA), создавшим PKCζ выражения клеточных линий. Поддержка со стороны Института молекулярной медицины Медицинского колледжа Джорджии / Грузия медицинских наук университета (под руководство доктора Лин Мей) также признается.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns | Miltenyi Biotec | ||
| Lipids (of highest purity) | Avanti Polar Lipid, Inc |
References
- Wang, G. Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells. J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).
- Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells. J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).
- Chalfant, C. E. De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1. J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).
- Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles. Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).
- Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. Biophysics (and sociology) of ceramides. Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).
- Kumagai, K. CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides. J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).
