Summary
Om de interactie van een proteïne test met haar doel lipide gebruikten we MACS en Annexine V-geconjugeerde magnetische kralen en lipide vesicles gesynthetiseerd uit het doel lipiden en Annexine V-bindend fosfatidylserine. Eiwitten gebonden aan de doelgroep lipide zijn co-gezuiverd en geanalyseerd na elutie van de kralen.
Abstract
De analyse van lipide-eiwit interacties is moeilijk omdat lipiden zijn ingebed in celmembranen en daarom ontoegankelijk voor de meeste zuivering procedures. Als alternatief kunnen lipiden worden gecoat op vlakke oppervlakken zoals gebruikt voor het lipide ELISA en Plasmon resonantie spectroscopie. Echter, coating lipiden vormen geen microdomain structuren, die belangrijk kan zijn voor de lipide bindende eigenschappen. Verder zijn deze methoden niet toe dat voor de zuivering van grotere hoeveelheden eiwitten te binden aan hun doel lipiden.
Om deze beperkingen van het testen van lipide-eiwit interacties en het lipide-bindende eiwitten te zuiveren ontwikkelden we een nieuwe methode genoemd lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van magnetische-geactiveerde cel sortering (LIMACS). Bij deze methode zijn lipide blaasjes bereid met het doel lipiden en fosfatidylserine als anker voor de lipide Annexine V MACS. Fosfatidylserine is een alomtegenwoordige celmembraan fosfolipide dat een hoge affiniteit voor het eiwit annexine V. Met behulp van magnetische korrels geconjugeerd aan Annexine V de fosfatidylserine-bevattende lipide vesicles zal binden aan de magnetische korrels laat zien. Als de lipide vesicles worden geïncubeerd met een cellysaat het eiwit binding aan het doel lipide zal ook gebonden aan de kralen en kan mede worden gezuiverd met behulp van MACS. Deze methode kan ook gebruikt worden om te testen of recombinante eiwitten reconstrueren een eiwit complex binding aan het doel lipide.
We hebben gebruik gemaakt van deze methode om de interactie van atypische PKC (aPKC) show met de sfingolipide ceramide en om samen te zuiveren prostaat apoptose respons 4 (PAR-4), een eiwit binding aan ceramide-geassocieerde aPKC. We hebben ook gebruik gemaakt van deze methode voor de reconstructie van een ceramide-geassocieerd complex van recombinant aPKC met de celpolariteit-gerelateerde eiwitten Par6 en Cdc42. Omdat lipide vesicles kunnen worden bereid met een verscheidenheid van sphingo-of fosfolipiden, LIMACS biedt een veelzijdige test voor lipide-eiwit interacties in een lipide omgeving die sterk lijkt op die van de celmembraan. Extra lipide-eiwit-complexen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van proteomics analyse van de lipiden bindend eiwit co-gezuiverd met het lipide blaasjes.
Protocol
1. Introductie
De lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van magnetische-geactiveerde cel sortering (LIMACS) techniek werd ontwikkeld in ons laboratorium te isoleren ceramide-geassocieerde eiwitcomplexen 1-3. Oorspronkelijk werden de lipide vesicles gemaakt van ceramide en fosfatidylserine, waardoor voor het MACS met behulp van magnetische deeltjes-geconjugeerd Annexine V (zeer affiene om fosfatidylserine) om de blaasjes en de bijbehorende eiwitten te isoleren. We hebben de LIMACS techniek voor de in vitro reconstitutie van een ceramide-geassocieerd polariteit complex en de isolatie van ceramide-bindende eiwitten uit cellysaten 3. LIMACS kan worden gewijzigd met behulp van andere interactiepartners voor de isolatie van de blaasjes (bijvoorbeeld glycolipide-specifeke lectinen of lipide antilichamen).
2. Experimentele procedures
Voorbereiding van lipide vesicles en aPKCBinding Assays
- Lipide blaasjes worden verkregen uit gedroogde mengsels van equimolaire hoeveelheden van fosfatidilserine (105 pg) en de C16-ceramide (85 ug) volgende gewijzigde procedures voor grote liposoom voorbereiding 1,4-7.
- De lipide mengsels zijn vervolgens geresuspendeerd en gesoniceerd gedurende 1 uur in 100 ul blaasje buffer die bestaat uit 50 mM Tris / HCl (pH 7,5) en 150 mM NaCl.
- Na het toevoegen van 300 pi van blaasje buffer aangevuld met 0,1 mM MnCl 2, worden de monsters gecentrifugeerd bij 12.000 μ g gedurende 20 min bij 4 ° C.
- De pellet (grote lipide blaasjes) wordt opnieuw gesuspendeerd in 100 ul van blaasje buffer en geïncubeerd met een nmol van Vybrant CM-dii gedurende 1 uur bij 37 ° C om de blaasjes fractie na scheiding MACS te visualiseren. Vybrant CM-dii is een rode fluorescente kleurstof die specifiek te nemen in lipide membranen.
- Een detergent-vrije cellysaat wordt bereid door sonicatie / homogenisering van de cellen in 300 ul van hypotone buffer (10 mM Tris / HCl (pH 7,0) met protease-inhibitoren en fosfatase), gevolgd door het verwijderen van membraneuze puin door middel van centrifugeren. Een centrifugatie stap bij 100.000 xg gedurende 1 uur moet worden toegevoegd om verontreiniging van het cellysaat met endogene membranen die fosfatidylserine te voorkomen.
- De gewist lysaat wordt toegevoegd aan de lipide bolletjes ophanging, en het mengsel wordt gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Het reactiemengsel wordt aangevuld met 20 ul van 20x Annexine V bindingsbuffer en 50 ul van een oplossing met magnetische korrels geconjugeerd aan Annexine V gevolgd door incubatie gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- MACS is uitgevoerd volgens de fabrikant (Miltenyi Biotec, Inc) protocol. De aanwezigheid en hoeveelheid van lipide vesicles wordt bepaald door het toezicht op de Vybrant CM-dii fluorescentie in de flow-through en elutie fracties met behulp van een microplaat fluorescentie lezer.
- De lineaire correlatie tussen de hoeveelheid van vesiculaire vet-en fluorescentie-intensiteit van vesikel-gebonden Vybrant CM-dii is geverifieerd door kwantitatieve high-performance thin-layer chromatografie (HPTLC) van de lipide mengsel toegepast op Annexine V-gebaseerde Macs.
- De specificiteit van de binding reactie van aPKC of andere eiwitten aan het ceramide / fosfatidylserine blaasjes wordt gecontroleerd door een antilichaam concurrentie test met behulp van 1 ug van het anti-PKCζ konijn polyklonaal antilichaam aan de cel lysaat gedurende 1 uur incuberen bij 4 ° C voorafgaand aan de incubatie met de lipide blaasjes.
- Het eiwit binding aan ceramide / fosfatidylserine blaasjes in de MACS eluaat wordt geanalyseerd door SDS-PAGE en immunoblotting.
In vitro lipide-eiwit polariteit complex
- De in vitro reconstitutie van een lipide-eiwit polariteit complex is uitgevoerd volgens de LIMACS procedure zoals beschreven in de vorige paragraaf. In het kort, phosphatidylserine (420 pg) en de C16-ceramide (107 ug) wordt gedroogd van organische oplosmiddelen.
- De gedroogde lipiden zijn geresuspendeerd onder sonicatie in 500 pi van vesicle buffer (50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl).
- Vijf ul van 10 mM MnCl2, 1 ui Vybrant CM-dii, en 500 ng van PKCζ (menselijke recombinant) wordt toegevoegd en het reactiemengsel geïncubeerd undergentle agitatie gedurende 60 min bij 4 ° C.
- Vybrant CM-dii-lood fosfatidylserine / ceramide blaasjes worden teruggewonnen door middel van centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 60 min bij 4 ° C.
- De pellet (roze) is geresuspendeerd in 100 ul Tris-buffer en aangevuld met γS-GTP (100 uM), het BBP (1 mm), GST-Par6 (100 ng), of GST-Cdc42 (500 ng) en verder geïncubeerd gedurende 3 h bij 4 ° C (een andere combinatie van recombinante eiwitten van belang kan hier worden gebruikt).
- Annexine V-buffer (5 ul van een 20x voorraad-oplossing) en Annexine V-geconjugeerde magnetische korrels (50 ul) toegevoegd en het reactiemengsel geïncubeerd onder zacht schudden voor nog eens 30 min bij 4 ° C.
- Annexine V-MACS is uitgevoerd volgens het protocol van de leverancier zoals eerder beschreven. De elutie fractie (1 ml) is aangevuld met 10 ug van pure ovalbumine als neerslag hulp. Het eiwit wordt geconcentreerd door Wessel-Flugge neerslag en geanalyseerd door SDS-PAGE/immunoblotting zoals eerder beschreven 8.
- De hoeveelheid geëlueerd lipide vesicles wordt gekwantificeerd door de detectie van Vybrant CM-dii (roze) in de organische (chloroform / methanol) fase van het Wessel Flugge neerslag reactie. De hoeveelheid van de geanalyseerde eiwit is genormaliseerd op gelijke hoeveelheden van lipide blaasjes.
3. Resultaten
LIMACS zuivering van PKCζ-EGFP en de ceramide bindingsdomein C20ζ-EGFP
Een detergent-vrije lysaat van MDCK cellen die volledige lengte PKCζ C-terminaal gekoppeld aan groen fluorescerend eiwit (FLζ-EGFP) of een ceramide bindend domein in het C-terminus van PKCζ (C20ζ-EGFP) werd geïncubeerd met phosphatidylserine / ceramide blaasjes als beschreven in de experimentele procedures. Na elutie van de MACS kolom, werd geanalyseerd met behulp van eiwit immunoblotting en antistoffen tegen PKCζ en EGFP voor de detectie van het eiwit geëlueerd 2.
Figuur 1. LIMACS van EGFP-gelabeld PKCζ en de C-terminale fragment C20ζ met fosfatidylserine / ceramide blaasjes.
Detergent-vrije lysaten van MDCK cellen die EGFP (als een niet-bindend control), volledige lengte PKCζ-EGFP, of de ceramide binding, C-terminale fragment C20ζ-EGFP werden geïncubeerd met phosphatidylserine / ceramide blaasjes, zoals beschreven in de experimentele procedures sectie . Na het gebruik van LIMACS, werd eiwit geëlueerd met SDS sample buffer en geanalyseerd door SDS-PAGE en immunoblotting. Het linker paneel toont aan dat EGFP niet binden aan de blaasjes behouden met de Annexine V-linked magnetische korrels. De middelste en rechter paneel toont aan dat de volledige lengte PKCζ-EGFP en C20ζ-EGFP werden behouden door binding aan ceramide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor het testen van de specifieke interactie tussen een lipide en zijn bindend eiwit wordt belemmerd door inbedding van lipiden in het celmembraan. De celmembraan bestaat uit een mengsel van verschillende vetten en eiwitten en het is georganiseerd in lipide microdomeinen of vlotten. Daarom kan de co-zuivering van microdomeinen en eiwitten niet duidelijk onderscheiden of een eiwit direct bindt aan een lipide of slechts verrijkt met een microdomain structuur. Andere methoden met behulp van bepaalde lipiden gecoate op oppervlakken, zoals lipide ELISA of Plasmon resonantie spectroscopie kan detecteren de interactie van een specifieke lipide met een bindend eiwit .. Echter, om deze interactie te bepalen in een fysiologisch relevante membraan-omgeving, het oppervlak (bijvoorbeeld voor Plasmon resonantie spectroscopie) moet worden bekleed met lipide blaasjes of liposomen.
We ontwikkelden een nieuwe lipide vesicle bindingstest als een alternatief voor deze eerdere methodes. De nieuwigheid is afkomstig van het opnemen van een anker lipide (fosfatidylserine) in de blaasjes, die zorgt voor de isolatie van lipide blaasjes met Annexine V-geconjugeerde magnetische korrels. Daarom hebben we deze test genoemd lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van magnetische geactiveerde cel sortering (LIMACS). LIMACS kan worden uitgevoerd voor endogene proteïnen, eiwitten uitgedrukt in cellen, of recombinante eiwitten opgelost in een lipide eiwitcomplex 1-3.
Het eiwit gebonden aan het lipide vesicles kan dan worden hersteld door simpelweg het nemen van de MACS kolom van de magnetische stand en elueren met een geschikte buffer. Dit kan een enzym compatibele buffer om enzymactiviteit te meten in het eluaat of SDS sample buffer om eiwit analyse met behulp van SDS-PAGE en immunoblotting uit te voeren zijn. Bij gebruik van SDS sample buffer van de MACS kolom niet hoeft te worden verwijderd uit de magnetische stand, die zorgt voor behoud van de magnetische korrels op de stand.
Er zijn voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het gebruik van LIMACS. Natuurlijk kunt LIMACS niet gebruikt worden met een detergent lysaat, omdat dit zal vernietigen de lipide blaasjes. Ook moet worden getest als het bindende eiwit van het doelwit lipide ook bindt aan fosfatidylserine omdat dit lipide wordt gebruikt als een anker voor het binden van de blaasjes tot Annexine V-geconjugeerde magnetische korrels. . In sommige gevallen kan fosfatidylserine aantasting binding met het doelwit eiwit. Daarom negatieve controles en controles met verschillende hoeveelheden van fosfatidilserine moeten worden opgenomen in de test. Thesecontrols kan gemakkelijk worden uitgevoerd met behulp van lipide vesicles die alleen phosphatidylserine of een mengsel van phosphatidylserine met niet-bindende lipiden. Inclusief negatieve controles is ook vereist voor cellysaten dat een aanzienlijk deel van de endogene fosfatidylserine bevatten. Om te voorkomen dat contaminatie door endogene lipidemembranen of blaasjes is het raadzaam om de cel lysaat duidelijk door met een ultracentrifugatie stap voor stap 100.000 xg gedurende 1 uur Het is duidelijk dat lipide bindende eiwitten in het supernatant alleen kan worden cytosolische, dat is een beperking van de LIMACS procedure. Er is de mogelijkheid om LIMACS uit te breiden tot andere verankeren lipiden zoals GM1 en cholera toxine B subunit geconjugeerd met magnetische korrels.
We zijn momenteel het verkennen van het gebruik van lipide-specifieke antilichamen voor LIMACS, die maakt het gebruik van lipiden anker voor de voorbereiding van de blaasjes overbodig. Een van de positieve aspecten van LIMACS is de isolatie van de lipide-eiwit complex die het mogelijk maakt voor een verscheidenheid van eiwitten analysemethoden die niet uitvoerbaar zijn .. Zo hebben we gebruikt om een LIMACS gereconstitueerde polariteit eiwit complex van Par6/Cdc42 geassocieerd met ceramide-gebonden aPKC isoleren. Daarom LIMACS is een krachtige nieuwe methode voor de analyse en de isolatie van lipide-geassocieerd eiwit complexen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NIH beurzen R01NS046835 en R01AG034389, en de March of Dimes subsidie 6FY08-322. Een speciaal woord van dank is gewijd aan mevrouw Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), die enorm geholpen met haar inzicht in de MACS techniek. Miltenyi heeft royaal mits het materiaal wordt gebruikt voor de demonstratie van de experimenten zonder kosten. Ik ben ook dankbaar dat dr. Guanghu Wang (Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University, Augusta, GA) die de gegenereerde PKCζ uiten cellijnen. Ondersteuning door het Instituut voor Moleculaire Geneeskunde van het Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University (onder leiding van Dr Lin Mei) is ook erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns | Miltenyi Biotec | ||
| Lipids (of highest purity) | Avanti Polar Lipid, Inc |
References
- Wang, G. Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells. J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).
- Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells. J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).
- Chalfant, C. E. De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1. J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).
- Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles. Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).
- Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. Biophysics (and sociology) of ceramides. Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).
- Kumagai, K. CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides. J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).
