Summary
Per verificare l'interazione di una proteina con la sua lipidi obiettivo abbiamo utilizzato MACS e sfere magnetiche annessina V-coniugati e vescicole lipidiche sintetizzato dal lipidi target e annessina V-binding fosfatidilserina. Le proteine legate alla lipidi target sono co-purificati e analizzati dopo eluizione dal perline.
Abstract
L'analisi delle interazioni lipidi proteine è difficile perché i lipidi sono incorporati nelle membrane cellulari e quindi inaccessibili alla maggior parte delle procedure di purificazione. In alternativa, i lipidi possono essere rivestiti su superfici piane come usato per lipidi ELISA e Plasmon spettroscopia di risonanza. Tuttavia, lipidi rivestimento superficiale non formano strutture microdomini, che possono essere importanti per le proprietà dei lipidi vincolanti. Inoltre, questi metodi non consentono per la purificazione di grandi quantità di proteine leganti i lipidi alla loro destinazione.
Per superare queste limitazioni dei test interazioni lipidi e proteine per purificare lipidi proteine leganti abbiamo sviluppato un nuovo metodo chiamato vescicola lipidica mediata cromatografia di affinità utilizzando magnetica attivata cell sorting (LIMACS). In questo metodo, vescicole lipidiche sono preparati con i lipidi di destinazione e fosfatidilserina come lipidi di ancoraggio per annessina V MACS. Fosfatidilserina è un fosfolipide onnipresente membrana cellulare che mostra alta affinità per la proteina annessina V. Utilizzando sfere magnetiche annessina V coniugata con la fosfatidilserina contenenti vescicole lipidiche si legano al sfere magnetiche. Quando le vescicole lipidiche sono incubati con una cella lisato il legame proteico al lipidi obiettivo sarà anche legato ai talloni, possono essere co-purificato con MACS. Questo metodo può essere utilizzato anche per verificare se le proteine ricombinanti ricostituire un complesso proteina legante al lipidi di destinazione.
Abbiamo usato questo metodo per mostrare l'interazione di atipica PKC (aPKC) con la ceramide sfingolipidi e di co-purificare risposta apoptosi prostata 4 (PAR-4), una proteina vincolante per ceramide associati aPKC. Abbiamo inoltre usato questo metodo per la ricostituzione di un complesso di ceramidi associato di aPKC ricombinante con la cella polarità proteine correlate Par6 e Cdc42. Dal momento che le vescicole lipidiche possono essere preparati con una varietà di sphingo o fosfolipidi, LIMACS offre un test versatile per lipidi-proteina in un ambiente lipidico che ricorda da vicino quella della membrana cellulare. Ulteriori lipidi complessi proteici possono essere identificati mediante l'analisi proteomica di proteine lipidi legame co-purificato con le vescicole lipidiche.
Protocol
1. Introduzione
La vescicola-mediata cromatografia di affinità dei lipidi utilizzando magnetica attivata cell sorting (LIMACS) tecnica è stata sviluppata nel nostro laboratorio di isolare ceramide associate complessi proteici 1-3. In origine, le vescicole lipidiche erano fatti di ceramide e fosfatidilserina, che ha consentito di MACS utilizzando particelle magnetiche coniugate annessina V (molto affine a fosfatidilserina) per isolare le vescicole e le proteine associate. Abbiamo usato la tecnica LIMACS per la ricostituzione in vitro di un complesso di ceramidi associato polarità e l'isolamento di ceramide-proteine che legano da lisati cellulari 3. LIMACS possono essere modificati utilizzando l'interazione di altri partner per l'isolamento delle vescicole (ad esempio, glicolipide-specifc lectine o anticorpi lipidi).
2. Le procedure sperimentali
Preparazione di vescicole lipidiche e saggi aPKCBinding
- Vescicole lipidiche sono ottenuti da miscele secche di quantità equimolare di fosfatidilserina (105 mg) e C16-ceramide (85 mcg) a seguito di procedure di modifica per la grande preparazione liposomi 1,4-7.
- Le miscele di lipidi vengono poi risospese e sonicato per 1 h in 100 ml di buffer di vescicole composto da 50 mM Tris / HCl (pH 7,5) e 150 mM NaCl.
- Dopo aver aggiunto 300 ml di tampone vescicola integrato con 0,1 mM MnCl 2, i campioni sono centrifugati a 12,000 g μ per 20 minuti a 4 ° C.
- Il pellet (vescicole lipidiche grande) è risospeso in 100 ml di buffer di vescicole e incubate con 1 nmol di Vybrant CM-dii per 1 ora a 37 ° C per visualizzare la frazione vescicola dopo la separazione MACS. Vybrant CM-dii è un colorante rosso fluorescente specificamente inserire in membrane lipidiche.
- Un detergente senza lisato cellulare è preparato mediante ultrasuoni / omogeneizzazione di cellule in 300 ml di tampone ipotonico (10 mM Tris / HCl (pH 7,0) con inibitori della proteasi e fosfatasi), seguita da rimozione dei detriti membranosa per centrifugazione. Una fase di centrifugazione a 100.000 xg per 1 ora deve essere aggiunto per evitare la contaminazione del lisato cellulare con membrane endogena contenente fosfatidilserina.
- Il lisato eliminato viene aggiunta alla sospensione delle vescicole lipidiche, e la miscela è incubata per 2 ore a 4 ° C.
- La miscela di reazione è completata con 20 ml di tampone 20x annessina V vincolante e 50 ml di una soluzione contenente microsfere magnetiche coniugato con annessina V seguita da incubazione per 1 ora a 4 ° C.
- MACS è effettuata secondo le istruzioni del produttore (Miltenyi Biotec, Inc.) protocollo. La presenza e la quantità di vescicole lipidiche è determinata monitorando i Vybrant CM-dii fluorescenza nel flow-through e eluizione frazioni utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre.
- La correlazione lineare tra la quantità di lipidi vescicolare e intensità di fluorescenza di vescicole legato Vybrant CM-dii è verificato da quantitativa ad alte prestazioni cromatografia su strato sottile (HPTLC) della miscela lipidica applicato annessina V-Mac basati su.
- La specificità della reazione di legame di proteine o altri aPKC alla ceramide / fosfatidilserina vescicole è verificata mediante un test degli anticorpi concorrenza con 1 mg di anti-PKCζ anticorpo policlonale di coniglio per incubare il lisato cellulare per 1 ora a 4 ° C prima dell'incubazione con le vescicole lipidiche.
- Il legame con le proteine di ceramide / fosfatidilserina vescicole nell'eluato MACS è analizzata mediante SDS-PAGE e immunoblotting.
In vitro dei lipidi-proteina complessa polarità
- La ricostituzione in vitro di un complesso proteina-lipide polarità viene eseguito seguendo la procedura LIMACS come descritto nella sezione precedente. In breve, fosfatidilserina (420 mg) e C16-ceramide (107 mcg) viene essiccato da solvente organico.
- I lipidi secchi sono risospesi in sonicazione in 500 ml di buffer di vescicole (50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl).
- Cinque ml di 10 mM MnCl2, 1 l di Vybrant CM-dii, e 500 ng di PKCζ (ricombinante umano) è aggiunto e la miscela di reazione incubata undergentle agitazione per 60 minuti a 4 ° C.
- Vybrant CM-dii macchiato fosfatidilserina / ceramide vescicole sono recuperati per centrifugazione a 12.000 xg per 60 min a 4 ° C.
- Il pellet (rosa) è risospese in 100 microlitri di buffer Tris e integrato con γS-GTP (100 mM), il PIL (1 mm), GST-Par6 (100 ng), o GST-Cdc42 (500 ng) e ulteriormente incubate per 3 ore a 4 ° C (qualsiasi altra combinazione di proteine ricombinanti di interesse può essere utilizzato qui).
- Annessina V-buffer (5 ml di una soluzione di 20x stock) e sfere magnetiche annessina V-coniugato (50 ml) vengono aggiunti e la miscela di reazione incubata in agitazione per altri 30 minuti a 4 ° C.
- Annessina V-MACS viene eseguita seguendo il protocollo del fornitore come descritto in precedenza. La frazione di eluizione (1 ml) è integrato con 10 mcg di ovoalbumina pura come aiuto precipitazioni. La proteina è concentrata da Wessel-Flugge precipitazione e analizzati da SDS-PAGE/immunoblotting come descritto in precedenza 8.
- La quantità di vescicole lipidiche eluito viene quantificato il rilevamento di Vybrant CM-dii (rosa) nella (cloroformio / metanolo) fase organica della reazione Wessel precipitazioni Flugge. La quantità di proteine analizzate è normalizzata sulla stessa quantità di vescicole lipidiche.
3. Risultati
Purificazione LIMACS di PKCζ-EGFP e il dominio ceramide vincolante C20ζ-EGFP
Un detergente senza lisato di cellule che esprimono MDCK lunghezza PKCζ C-terminale legato alla proteina fluorescente verde (FLζ-EGFP) o un dominio ceramide vincolante nel C-terminale della PKCζ (C20ζ-EGFP) è stato incubato con fosfatidilserina / vescicole ceramide come descritto nelle procedure sperimentali. Dopo l'eluizione della colonna MACS, la proteina è stata analizzata con immunoblotting e gli anticorpi contro PKCζ e EGFP per la rilevazione della proteina eluita 2.
LIMACS Figura 1. EGFP di marcato PKCζ e il suo frammento C-terminale C20ζ utilizzando fosfatidilserina / ceramide vescicole.
Detergente senza lisati di cellule che esprimono MDCK EGFP (come non vincolante di controllo), a figura intera PKCζ-EGFP, o il legame ceramide, frammento C-terminale C20ζ-EGFP sono stati incubati con fosfatidilserina / vescicole ceramide, come descritto nella sezione sperimentale Procedure . Dopo aver utilizzato LIMACS, proteina è stata eluita con tampone campione SDS e analizzati mediante SDS-PAGE e immunoblotting. Il pannello di sinistra mostra che EGFP non si sono legati al vescicole mantenuto con il V-linked perline annessina magnetico. Il pannello centrale e di destra mostra che la lunghezza totale PKCζ-EGFP e C20ζ-EGFP sono stati mantenuti dovuto al legame di ceramide.
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Discussion
Per testare l'interazione specifica tra un lipide e il suo legame con le proteine è ostacolata dalla incorporazione di lipidi nella membrana cellulare. La membrana cellulare è costituita da una miscela di lipidi e proteine diverse, ed è organizzato in microdomini lipidici o zattere. Pertanto, il co-purificazione di proteine microdomini e non è possibile distinguere se una proteina che si lega direttamente a un lipidi o è solo arricchito in una struttura microdomini. Altri metodi utilizzando lipidi definito rivestito su superfici come ELISA lipidi o Plasmon spettroscopia di risonanza in grado di rilevare l'interazione di un lipide specifico con il suo legame con le proteine .. Tuttavia, a determinare questa interazione in un ambiente membrana fisiologicamente rilevanti, la superficie (ad esempio, per Plasmon spettroscopia di risonanza) deve essere rivestita con vescicole lipidiche e liposomi.
Abbiamo sviluppato un nuovo metodo di analisi dei lipidi vincolante vescicola come alternativa a questi metodi precedenti. La novità viene da incorpora un lipide di ancoraggio (fosfatidilserina) in vescicole, che consente l'isolamento di vescicole lipidiche con sfere magnetiche annessina V-coniugati. Pertanto, abbiamo chiamato questo saggio vescicole lipidiche-mediata cromatografia di affinità utilizzando magnetico ordinamento attivato cella (LIMACS). LIMACS può essere eseguita per le proteine endogene, proteine espresse nelle cellule, o proteine ricombinanti ricostituito in un complesso di proteine lipidi 1-3.
La proteina legata al vescicole lipidiche possono essere recuperati semplicemente prendendo la colonna MACS dal supporto magnetico e eluizione di farmaco con un buffer adeguato. Questo può essere un buffer enzima compatibile per misurare l'attività enzimatica nell'eluato o buffer campione SDS per eseguire analisi delle proteine mediante SDS-PAGE e immunoblotting. Se si utilizza buffer di campione SDS colonna MACS non deve essere rimosso dal supporto magnetico, che consente la conservazione delle perline magnetiche sul supporto.
Ci sono precauzioni da adottare quando si usa LIMACS. Evidentemente, LIMACS non può essere utilizzato con un lisato detergente perché questo distruggerà le vescicole lipidiche. Inoltre, deve essere testato se il legame proteico del lipidi obiettivo si lega anche alla fosfatidilserina, perché questo lipide è utilizzato come ancoraggio per il legame delle vescicole di sfere magnetiche annessina V-coniugati. . In alcuni casi, fosfatidilserina può compromettere legame alla proteina bersaglio. Pertanto, i controlli negativi e controlli con varie quantità di fosfatidilserina devono essere inclusi nel test. Thesecontrols può essere facilmente eseguita utilizzando vescicole lipidiche che contengono solo fosfatidilserina o una miscela di fosfatidilserina non vincolanti lipidi. Inclusi i controlli negativi è necessario anche per lisati di cellule che contengono una quantità significativa di fosfatidilserina endogeni. Per evitare la contaminazione con le membrane lipidiche endogene o vescicole si consiglia di eliminare il lisato cellulare inserendo un passo ultracentrifugazione a 100.000 xg per 1 h. E 'evidente che lipidi proteine leganti nel supernatante può essere solo citosolico, che è una limitazione della procedura LIMACS. C'è la possibilità di estendere LIMACS ai lipidi altri ancora, come GM1 e subunità B della tossina colerica coniugata con sfere magnetiche.
Attualmente stiamo esplorando l'uso di lipidi anticorpi specifici per LIMACS, che renderebbe l'uso di lipidi di ancoraggio per la preparazione delle vescicole inutili. Uno degli aspetti benefici del LIMACS è l'isolamento del complesso di proteine lipidi che permette una varietà di metodi di analisi delle proteine che non sono attuabili .. Per esempio, abbiamo usato LIMACS per isolare un complesso proteico ricostituito polarità del Par6/Cdc42 associati con ceramide-bound aPKC. Pertanto, LIMACS è un nuovo metodo potente per l'analisi e l'isolamento di lipidi complessi proteici associati.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal NIH R01NS046835 e R01AG034389, e il March of Dimes concedere 6FY08-322. Un ringraziamento speciale è dedicata alla signora Eleonora Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) che ha contribuito enormemente con la sua comprensione della tecnologia MACS. Miltenyi ha generosamente fornito il materiale utilizzato per la dimostrazione degli esperimenti senza alcun costo. Sono anche grato al Dr. Guanghu Wang (Medical College della Georgia / Georgia Health Sciences University, Augusta, GA), che ha generato il PKCζ esprimere linee cellulari. Supporto per l'Istituto di Medicina Molecolare presso il Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University (in direzione del Dott. Lin Mei) è anche riconosciuto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns | Miltenyi Biotec | ||
| Lipids (of highest purity) | Avanti Polar Lipid, Inc |
References
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