Summary
为了测试我们使用Macs和Annexin V的共轭磁珠和目标脂质和Annexin V的具有约束力的磷脂酰丝氨酸合成脂质囊泡与目标脂质的一种蛋白质的相互作用。绑定到目标脂质蛋白质纯化和分析后，从珠洗脱。
Abstract
脂蛋白质相互作用的分析是困难的，因为嵌在细胞膜的脂质，因此，无法以最净化程序。血脂作为一种替代方法，可以在平坦的表面涂层，为脂质ELISA法和等离子体共振光谱。然而，表面涂层血脂不形成微区结构，这可能是重要的脂质绑定属性。此外，这些方法不容许较大数额的蛋白结合他们的目标血脂净化。
为了克服这些限制测试脂蛋白质相互作用和净化脂质结合蛋白，我们开发了一种新的方法称为脂质囊泡介导的亲和层析法，使用磁激活细胞分选（LIMACS）。在此方法中，脂质囊泡锚脂质膜联蛋白V的Mac与目标脂质和磷脂酰准备。磷脂是一个无处不在的细胞膜磷脂，高亲和力的蛋白膜联蛋白V。使用Annexin V的共轭含有的磷脂脂质囊泡结合磁珠磁珠。当脂质囊泡与细胞培养裂解的蛋白结合的目标脂质也将受到约束珠，可以共同使用Mac纯化。这种方法也可以用来测试一个目标脂质蛋白复合物结合，如果重组蛋白重组。
我们已经用这种方法，以显示与鞘脂酰胺和合作净化前列腺凋亡反应4（4杆），蛋白结合酰胺相关aPKC非典型蛋白激酶C（aPKC）的相互作用。我们也使用这种方法，重组的重组aPKC神经酰胺与细胞极性相关的蛋白质Par6和Cdc42复杂。由于脂质囊泡可以与各种sphingo或磷脂准备，LIMACS脂质 - 蛋白相互作用密切类似于细胞膜的脂质环境提供了通用的测试。其他脂质蛋白复合物可以识别使用的脂质结合蛋白与脂质囊泡的合作纯化的蛋白质组学分析。
Protocol
1。简介
在我们的实验室开发的脂质囊泡介导的亲和层析法，使用磁激活细胞分选（LIMACS）技术隔离酰胺相关的蛋白质复合物1-3。本来，脂质囊泡酰胺和磷脂酰丝氨酸，允许使用磁粒子标记的膜联蛋白V（高度仿射磷脂酰丝氨酸）隔离囊泡及其相关蛋白的Mac。我们已经使用的LIMACS 技术，在体外再造一个酰胺相关的极性复杂，从细胞神经酰胺结合蛋白的分离裂解液3。 LIMACS可以修改囊泡（例如，糖脂specifc凝集素或脂质抗体）的隔离使用其他互动的合作伙伴。
2。实验步骤
脂质囊泡的制备和aPKCBinding分析
- 脂质囊泡获得干混合物的摩尔量的磷脂酰丝氨酸（105微克）和C16 -神经酰胺（85微克）以下程序修改为大脂质体的制备1,4-7。
- 脂质混合物，然后再悬浮和超声在100μL的50 mM的Tris /盐酸（pH值7.5）和150毫米氯化钠组成的囊泡缓冲区1小时。
- 加入300辅以0.1毫米MnCl 2囊泡缓冲液后，样品离心20分钟12,000μ 克在4 ° C
- 颗粒（大脂质囊泡）是悬浮于100μL囊泡缓冲区，并在37℃1小时Vybrant CM - DII与1 nmol孵育° C至可视化磁珠分离后的囊泡分数。 Vybrant CM - DII是一种红色荧光染料，特别纳入到脂膜。
- 洗涤剂无细胞裂解液，超声/ 300低渗缓冲离心去除膜碎片（10毫米的Tris / HCL（pH值7.0），蛋白酶和磷酸酶抑制剂）液中的细胞同质化的准备。应在1小时10 XG的离心步骤，以避免污染的细胞裂解液中含有内源性膜磷脂酰。
- 清除裂解物被添加到脂质囊泡悬挂，混合物在4 ° C孵育2 h
- 反应混合物20μL20X Annexin V的结合缓冲液和50μL含有磁珠标记Annexin V的解决方案的补充，其次是潜伏期为1小时在4 ° C
- MACS是根据制造商的协议（美天旎生物技术公司）。脂质囊泡的存在和数量是由监察Vybrant CM - DII通过流量和洗脱用酶标仪荧光读者分数荧光。
- 水泡脂量和荧光强度之间的线性相关囊泡约束Vybrant CM - DII是由高性能定量薄层色谱法（薄层）应用于膜联蛋白V的Mac脂混合物验证。
- aPKC或其他蛋白质的结合反应的特异性神经酰胺/磷脂酰丝氨酸的囊泡竞争，使用1微克的反PKCζ兔多克隆抗体孵育1 h后的细胞裂解液在4 ° C到孵化前的抗体检测验证脂质囊泡。
- SDS - PAGE电泳和免疫印迹分析蛋白结合的Mac洗脱液酰胺/磷脂酰丝氨酸的囊泡。
在体外脂质蛋白的极性复杂
- 在体外重组脂质蛋白极性复杂LIMACS程序后，在上一节所述。在简短，磷脂酰丝氨酸（420微克）和C16 -神经酰胺（107微克）是有机溶剂干燥。
- 干血脂悬浮下超声在500囊泡缓冲液（50 mM的三/盐酸，pH值7.5; 150 mM氯化钠）。
- 五μL10 mM的氯化锰，1μLVybrant CM - DII，和500PKCζ吴（重组人）和反应混合物孵育60分钟undergentle鼓动在4 ° C。
- 60分钟在4 ° C离心Vybrant CM - DII染色的磷脂酰丝氨酸/酰胺囊泡回收12000 XG
- 颗粒（粉红色），悬浮于100μLTris缓冲液，并辅以γS- GTP（100μM），国内生产总值（1毫米），GST - Par6（100毫微克），或（500纳克）GST - Cdc42的，并进一步培养3在4 h ° C（ 任何其他利益的重组蛋白结合，这里可以使用） 。
- Annexin V的缓冲液（5μL20倍原液）和Annexin V的共轭磁珠（50μL）的增加和反应混合物轻轻摇动下孵育另一个30分钟，4 ° C。
- 膜联蛋白V - MACS执行以下供应商的协议，如前所述。 洗脱分数（1毫升）补充10微克的纯卵清蛋白沉淀援助。韦塞尔- Flugge降水集中的蛋白质和SDS-PAGE/immunoblotting如先前所描述的8分析。
- 量化Vybrant CM - DII（粉红色）在有机相（氯仿/甲醇）韦塞尔Flugge沉淀反应检测洗脱脂质囊泡的数量。分析蛋白质的量是等量的脂质囊泡归。
3。结果
LIMACSPKCζ- EGFP和神经酰胺结合域C20ζ- EGFP的净化
一个洗涤剂无裂解MDCK细胞表达全长PKCζC端与绿色荧光蛋白（FLζEGFP）基因或神经酰胺在PKCζ（C20ζ- EGFP）C -末端结合域的培养与磷脂酰丝氨酸/酰胺囊泡描述了实验步骤。 MACS柱洗脱后，用免疫印迹和PKCζ和EGFP的检测洗脱蛋白2抗体蛋白进行了分析。
图1。LIMACS EGFP -标记PKCζ和C -末端片段C20ζ使用磷脂酰丝氨酸/酰胺囊泡。
MDCK细胞表达EGFP（作为一个不具约束力的的控制），全长PKCζ- EGFP，或神经酰胺结合，C -末端片段C20ζ- EGFP的洗涤剂裂解液孵育实验程序部分所述与磷脂酰丝氨酸/酰胺囊泡。使用LIMACS后，SDS样品缓冲液洗脱蛋白，并用SDS - PAGE分析和免疫印迹。左侧面板显示，EGFP的没有约束力的V -膜联蛋白磁珠保留水疱。中间和右边的面板显示，全长PKCζ- EGFP和C20ζ- EGFP的保留绑定酰胺。
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Discussion
要测试的脂质和蛋白之间的相互作用，是阻碍嵌入细胞膜的脂质。细胞膜由一些脂类和蛋白质的混合物，它是在组织脂质微区或木筏。因此，微区和蛋白质的合作，净化不能明确区分，如果一种蛋白质直接结合到脂质，或仅仅是在微区结构丰富。使用涂层表面上，如脂质酶联免疫吸附或等离子体共振光谱的定义血脂的其他方法可以检测其结合蛋白的一个特定的脂质相互作用..然而，在一个有关生理膜环境，以确定这种互动，脂质囊泡或脂质体与涂层表面（例如，等离子体共振光谱）。
我们开发了一种新的脂质囊泡结合实验作为替代这些以前的方法。新鲜感来自纳入囊泡，脂质囊泡与膜联蛋白V -共轭磁珠隔离允许一个锚脂质（磷脂酰丝氨酸）。因此，我们称之为这种检测脂质囊泡介导的亲和层析法，使用磁激活细胞分选（LIMACS）。 LIMACS可用于内源性蛋白，在细胞中，或重组蛋白表达的蛋白质重组 1-3脂质蛋白复合物。
绑定脂质囊泡的蛋白，然后可以收回简单地从磁立场MACS柱和洗脱一个适当的缓冲区。这可能是一种酶兼容的缓冲区来衡量洗脱液SDS样品缓冲液进行蛋白质分析，使用SDS - PAGE和免疫印迹酶的活性。如果使用SDS样品缓冲液的Mac列没有磁性的立场，允许保留的立场上的磁珠删除。
在使用LIMACS时要采取的预防措施。由此可见，LIMACS不能使用清洁剂的裂解液，因为这会破坏脂质囊泡。此外，它已进行测试，如果目标脂质结合蛋白结合磷脂酰丝氨酸，因为此脂质囊泡Annexin V的共轭磁珠结合的锚。 。在某些情况下，磷脂酰丝氨酸，可能会损害靶蛋白结合。因此，阴性对照和磷脂酰丝氨酸的各种款项的控制检测。 Thesecontrols可以很容易地使用只含有磷脂酰丝氨酸或一个不具约束力的脂质磷脂酰的混合物的脂质囊泡。包括阴性对照，还需要为细胞裂解液中含有大量的内源性磷脂酰。为了避免污染与内源性脂质膜囊泡或建议，以清除包括100,000 XG的离心步骤1小时的细胞裂解液很明显，上清液中的脂质结合蛋白只能细胞质，这是一个限制的LIMACS过程中。有可能延长LIMACS GM1和霍乱毒素B亚基与磁珠结合，如其他锚血脂。
目前，我们正在探索为LIMACS脂质特异性抗体的使用，这将使锚脂质囊泡准备使用不必要的。 LIMACS有利的方面之一是允许的各种蛋白质分析方法，是不是可执行的脂质蛋白复合物的隔离..例如，我们已经使用LIMACS隔离Par6/Cdc42重组极性蛋白复合物与神经酰胺，势必aPKC。因此，LIMACS脂质相关的蛋白质复合物的分析和隔离是一个强大的新方法。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院拨款R01NS046835和R01AG034389，三月优生优育基金会授予6FY08 - 322的支持。特别感谢你致力于夫人埃莉诺布朗（美天旎生物技术，赤褐色，CA），极大地帮助她的洞察力到MACS科技。美天旎慷慨地提供实验示范使用，不需任何费用的材料。我也很感谢博士王广沪（医学院格鲁吉亚/格鲁吉亚卫生科学大学，奥古斯塔，佐治亚州）表达细胞株产生的PKCζ。也承认在格鲁吉亚/佐治亚州健康科学大学（下林美博士的董事）医学院分子医学研究所的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns | Miltenyi Biotec | ||
| Lipids (of highest purity) | Avanti Polar Lipid, Inc |
References
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