Vi visar en<em> In vivo</em> Elektroporation protokoll för transfecting enstaka eller små grupper av retinal ganglion celler (RGC: er) och andra retinal celltyper i postnatala möss över ett brett spektrum av åldrar. Förmågan att märka och genetiskt manipulera postnatal RGC: er<em> In vivo</em> Är ett kraftfullt verktyg för utvecklingsstudier.
Den inriktning och förädling av RGC prognoser till mitthjärnan är en populär och kraftfull modell för att studera hur exakt mönster av neurala anslutning bildas under utveckling. Hos möss är retinofugal projektioner arrangerade i en topografisk sätt och bildar ögon-specifika lager i Lateral geniculate Nucleus (dLGN) av thalamus och Superior colliculi (SC). Utvecklingen av dessa exakta mönster av retinofugal prognoser har ofta studerats av märkning populationer av RGC: er med fluorescerande färger och spårämnen, som pepparrotsperoxidas 1-4. Men dessa metoder är för grov för att ge insikt i utvecklingsmässiga förändringar i enskilda RGC axonal berså morfologi som ligger till grund för retinotopic karta bildas. De tillåter inte heller för genetisk manipulation av RGC: er.
Nyligen har elektroporation blivit en effektiv metod för att ge exakt tid och kontroll för leverans av laddade molekyler i näthinnan 5-11. Aktuell näthinnan elektroporation protokollen tillåter inte genetisk manipulation och spårning av retinofugal projektioner av en enda eller små kluster av RGC: er i postnatal möss. Det har hävdats att postnatal in vivo elektroporering är inte en hållbar metod för transfecting RGC: er eftersom märkningen effektivitet är mycket låg och kräver därför riktade på embryonala åldrar när RGC stamceller genomgår differentiering och proliferation 6.
I denna video beskriver vi en in vivo-elektroporering protokoll för målstyrning av gener, shRNA, och fluorescerande dextraner mot murina RGC: er efter födseln. Denna teknik ger en kostnadseffektiv, snabb och relativt enkel plattform för effektiv screening av gener involverade i flera delar av neurala utveckling inklusive axonet dementi, förgrening, laminering, förnyelse och synaps bildning i olika stadier av kretsen utveckling. Sammanfattningsvis beskriver vi här ett värdefullt verktyg som kommer att ge ytterligare insikter i de molekylära mekanismerna bakom sensorisk kartan utveckling.
I denna video visar vi ett in vivo-elektroporering protokoll som resulterar i märkningen av enskilda eller små grupper av näthinnans nervceller i postnatala möss med DNA-konstruktioner kodning fluorescerande proteiner. Små grupper av fluorescerande RGC prognoser till dLGN och SC reproduceras liknande projektion mönster som tidigare studier med RGC märkning med lipofila färgämnen, vilket indikerar att elektroporation inte störa normala RGC axonet berså förfining. Vi har utnyttjat detta protokoll för…
The authors have nothing to disclose.
Den pCAG-gapEGFP plasmid var en gåva från Dr S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plasmid var en gåva från Dr M. Feller (Berkeley, CA). Vi tackar Dr Edward Ruthazer för att föreslå användning av en två-plasmid strategi för enskild cell märkning och Anne Schohl (Montreal, QC) för att validera två plasmid Cre / loxP strategi i förstudier och Crair medlemmar lab för teknisk support. Med stöd av R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) och NIH P30 EY000785 (MC).
Materials | Company | Catalog number |
---|---|---|
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
Electrical Stimulator | Grass Instruments | Model S4 |
Oscilloscope | Agilent | Model 54621A |
Audio monitor | Grass Instruments | Model AM8B |
Puller | Sutter Instruments | Model P-97 |
Vannas Scissors a | World Precision Instruments | 14003 |
Micro Scissors b | Ted Pella | 1347 |
Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 |
Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 |
Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 |
DiI | Invitrogen | D-383 |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |