Programmerad celldöd analyser som vanligen används i däggdjur system såsom DNA laddering eller analyser Tunel, är ofta svåra att återge i växter. I kombination med en GUS reporter system, föreslår vi en snabb, växtbaserade övergående analys för att analysera potentiella död egenskaper specifika gener.
Vi har utvecklat ett nytt tillfälligt system som växt uttryck som samtidigt uttrycker reporter genen, β-glukuronidas (GUS), med förmodad positiv eller negativ regulatorer av celldöd. I detta system, N. benthamiana bladen är co-infiltrerade med en 35S driven uttryck kassett som innehåller genen som ska analyseras, och GUS vektor pCAMBIA 2301 med hjälp av Agrobacterium stam LBA4404 som ett fordon. Eftersom levande celler krävs för GUS uttryck att inträffa, är förlust av GUS aktiviteten förväntas när detta markörgen är co-uttrycks med positiva regulatorer av celldöd. Likaså ökade GUS aktivitet observeras när anti-apoptotiska gener används jämfört med vektorstyrning. Som framgår nedan har vi använt med framgång detta system i vårt labb för analys av både pro-och anti-döden-spelare. Dessa inkluderar anläggningen anti-apoptotiska Bcl-2 associerad athanoGene (BAG) familj, liksom, känd däggdjursceller inducerar celldöd, såsom BAX. Dessutom har vi använt detta system för att analysera död funktionen av specifika truncations inom proteiner, som skulle kunna ge ledtrådar om eventuella post-translationell modifiering / aktivering av dessa proteiner. Här presenterar vi en snabb och känslig växt baserad metod, som ett första steg i utredningen av dödsfallet funktionen av specifika gener.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Rifampicin | VWR | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
Bacto-tryptone | Fisher | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
Bacto-yeast extract | VWR | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
Sodium chloride | VWR | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
N-Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
β-Methylumbelliferone (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
Sodium carbonate | VWR | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |