Summary
وصفنا بروتوكول لتصنيع أجهزة ميكروفلويديك التي تتيح التقاط الخلايا والثقافة. في هذا النهج تستخدم المجهرية منقوشة مثل الأخاديد داخل قنوات ميكروفلويديك لإنشاء مناطق منخفضة إجهاد القص داخل الخلية والتي يمكنها ان ترسو.
Abstract
نحن تصف جهاز ميكروفلويديك مع أنماط السلوك microgrooved لدراسة الخلوية. هذه المنصة ميكروفلويديك يتكون من قناة fluidic العلوي والسفلي ركيزة microgrooved. الى افتعال القنوات microgrooved ، كان أحد كبار محاذاة بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) العفن الذي يحتوي على انطباع من القنوات ميكروفلويديك والمستعبدين من ركيزة microgrooved. باستخدام هذا الجهاز ، وكانت الخلايا الليفية يجمد الماوس ومنقوشة داخل ركائز microgrooved (25 ، 50 ، 75 ، وعرضها 100 ميكرون). وكان لدراسة الخلايا في جهاز ميكروفلويديك ، perfused وسائل الإعلام التي تحتوي على بيروكسيد الهيدروجين ، والخامس Annexin ، ويوديد propidium fluidic في القناة لمدة 2 ساعة. وجدنا أن الخلايا المعرضة للالاكسدة أصبحت أفكارك. وتأكدت هذه الخلايا أفكارك قبل الخامس Annexin أن منضمة إلى فسفاتيديل في النشرة الخارجي للغشاء البلازما أثناء عملية موت الخلايا المبرمج. باستخدام هذا الجهاز ميكروفلويديك مع أنماط microgrooved ، لوحظ في عملية موت الخلايا المبرمج في الوقت الحقيقي وتحليلها باستخدام ميكروسكوب مقلوب يحتوي على غرفة الحضانة (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2). لذلك ، يمكن لهذا الجهاز ميكروفلويديك تدمج مع ركائز microgrooved تكون مفيدة لدراسة سلوك وأداء الخلوية عالية الإنتاجية فحص المخدرات.
Protocol
ألف التصنيع الدقيق للجهاز ميكروفلويديك
- يعامل 4 بوصة رقاقة سيليكون مع البلازما الاكسجين التفاعلية (5 دقائق في 30W ، Harrick العلمية ونيويورك).
- مقاوم الضوء السلبية (SU - 8 2015 ، Microchem ، MA) هو زيادة ونقصان المغلفة عند 900 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة على رقاقة سيليكون.
- رقاقة لينة المخبوزة في 95 درجة مئوية لمدة 6 دقائق على موقد ويتعرضون لضوء الأشعة فوق البنفسجية (200W) لمدة 4 دقائق من خلال فيلم قناع يحتوي microchannels.
- الرقاقة هو خبز في آخر 95 درجة مئوية لمدة 6 دقائق وتطويرها باستخدام SU - 8 المطور مقاومة للضوء.
- يتم وضع رقاقة منقوشة مقاوم الضوء تحتوي microchannels في طبق بتري.
- هي ملفقة بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) قوالب السيليكون التي الاستومر الاختلاط وكيل علاج (10:1 نسبة).
- يسكب الخليط PDMS على القالب الرئيسي سي وضعها على فراغ مجفف لإزالة الفقاعات.
- غير مملح PDMS في 70 درجة مئوية لمدة 1 2 ساعة ~.
- ومقشر ثم قوالب PDMS الخروج من القالب الرئيسي سي.
B. تجميع الجهاز
- ويتم الحصول على 40 ميكرومتر سميكة أعلى قنوات fluidic و 40 ميكرون قنوات أسفل microgrooved سميكة (25 ، 50 ، 75 ، و 100 واسعة μ م) من اثنين من مختلف القوالب الرئيسي سي.
- واللكم قناة مدخل ومخرج الجهاز fluidic.
- مستعبدين بشكل لا رجعة فيه قنوات وقنوات Fluidic مرسمة مجهارية بواسطة البلازما الاكسجين التفاعلية (5 دقائق في 30W ، Harrick العلمية ونيويورك).
- وهي مغلفة المصفوفة خارج الخلية (ECM) (أي فبرونيكتين) داخل جهاز ميكروفلويديك لمدة 1 ساعة في حاضنة (37 درجة مئوية).
جيم بذر الخلية والإعداد التجريبية
- يتم استزراع الخلايا الليفية الماوس NIH - 3T3 في نسيج الثقافة القارورة باستخدام وسائل الإعلام في التعديل Dulbecco النسر (DMEM) تحتوي على 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS).
- الخلايا trypsinized وفصلها.
- فصل الخلايا يتم تحميلها في القنوات مرسمة مجهارية في كثافة خلية من 3 × 10 6 خلية / مل (الشكل 1).
الشكل 1
- وسائل الإعلام التي غرست 2 مل ، 100 ملي مول H 2 O 2 ، ومقايسة موت الخلايا المبرمج (20 ميكرولتر Annexin V و 40 يوديد propidium ميكرولتر ، Invitrogen ، CA) إلى قناة باستخدام مضخة محقنة (1 ميكروليتر / دقيقة).
- الخلايا في الوقت الحقيقي رصد باستخدام مجهر مقلوب (نيكون TE 2000).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويجمد منقوشة داخل الخلايا وركائز microgrooved في جهاز ميكروفلويديك. ولوحظ في عملية موت الخلايا المبرمج للخلايا تعرضت لبيروكسيد الهيدروجين في الوقت الحقيقي وتحليلها باستخدام Annexin الخامس ويوديد propidium. وبالتالي ، يمكن لهذا الجهاز يحتوي على قنوات ميكروفلويديك مرسمة مجهارية تكون مفيدة لفحص المخدرات الإنتاجية العالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) |
| DMEM | medium | Invitrogen | 11965 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Media |
| FBS | serum | Invitrogen | 10082-147 | Fetal Bovine Serum |
| Hydrogen peroxide | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Apoptosis assay | Invitrogen | V13242 | Annexin A, propidium iodide | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 2015 | ||
| Si wafer | Tool | 4 inch silicone wafer | ||
| Reactive oxygen plasma | Reagent | Harrick Scientific Products, Inc. | treat wafer 5 min at 30W | |
| inverted microscope | Tool | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
- Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
- Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).
