Summary
Nós descrevemos um protocolo para a fabricação de dispositivos microfluídicos que pode permitir a captura de células e cultura. Nesta abordagem padronizada microestruturas, tais como sulcos dentro de canais microfluídicos são usados para criar regiões de cisalhamento de baixa tensão dentro do qual célula pode encaixar.
Abstract
Nós descrevemos um dispositivo micro com padrões microgrooved para estudar o comportamento celular. Esta plataforma microfluídica consiste de um canal top fluídico e um substrato de fundo microgrooved. Para fabricar os canais microgrooved, um top poli (dimetilsiloxano) molde (PDMS), contendo a impressão dos canais microfluídicos foram alinhados e ligados a um substrato microgrooved. Usando este dispositivo, as células de fibroblastos de rato foram imobilizados e padronizada dentro de substratos microgrooved (25, 50, 75 e 100 mm de largura). Estudar a apoptose em um dispositivo micro, mídia contendo peróxido de hidrogênio, anexina V e iodeto de propídio foi perfundido para o canal fluídico por 2 horas. Descobrimos que as células expostas ao estresse oxidativo se tornou apoptóticos. Estas células em apoptose foram confirmadas pela anexina V que obrigado a fosfatidilserina no folheto externo da membrana plasmática durante o processo de apoptose. Usando este dispositivo micro com padrões microgrooved, o processo de apoptose foi observado em tempo real e analisadas utilizando um microscópio invertido contendo uma câmara de incubação (37 ° C CO, 5% 2). Portanto, este dispositivo micro incorporado com substratos microgrooved poderia ser útil para estudar o comportamento celular e desempenho high-throughput screening de drogas.
Protocol
A. Microfabricação do dispositivo micro
- De 4 polegadas wafer Si é tratada com plasma de oxigênio reativo (5 min a 30W, Harrick Científico, NY).
- Fotorresiste negativo (SU-8 2015, Microchem, MA) é spin-revestido a 900 rpm por 1 min em um wafer de silício.
- O wafer é mole cozido a 95 ° C por 6 min numa placa de aquecimento e é exposto à luz UV (200W) por 4 min através de um filme de máscara contendo microcanais.
- O wafer é pós cozido a 95 ° C por 6 min e é desenvolvido usando SU-8 desenvolvedor fotorresiste.
- O wafer fotorresiste padronizada contendo microcanais é colocado em um prato de Petri.
- Moldes de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) (Sylgard 184) são fabricados pela mistura de elastômero de silicone e um agente de cura (10:1).
- A mistura PDMS é derramado no molde mestre Si e é colocado em um dessecador a vácuo para remover as bolhas.
- PDMS é curado a 70 ° C por 1 ~ 2 horas.
- Moldes PDMS são, então, tirou do molde mestre Si.
B. Montagem do dispositivo
- 40 mm de espessura superior canais fluídicos e 40 mM canais de fundo grosso microgrooved (25, 50, 75 e 100 μ m de largura) são obtidos a partir de dois moldes diferentes mestre Si.
- Canal de entrada e saída do dispositivo fluídico são perfurados.
- Canais fluídicos e Micro-canais estão irreversivelmente ligados pelo plasma reativas de oxigênio (5 min de 30W, Harrick Científico, NY).
- Matriz extracelular (ECM) (ie fibronectina) é revestido no interior do dispositivo microfluídicos para uma hora em estufa (37 ° C).
C. semeadura Celular e montagem experimental
- Fibroblastos NIH-3T3 mouse são cultivadas em um frasco de cultura de tecidos utilizando o Media Modified Dulbecco Águia (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS).
- Células são tripsinizados e dissociado.
- Células dissociadas são carregados para os canais de Prêmios Prêmios na densidade das células de 3 x 10 6 células / ml (Figura 1).
Figura 1
- 2 mL de mídia, 100 mM H 2 O 2, e ensaio de apoptose (20 mL anexina V e iodeto de propídio 40 mL, Invitrogen, CA) são infundidos em um canal usando uma bomba de seringa (1 ml / min).
- Células são monitorados em tempo real, usando um microscópio invertido (Nikon TE 2000).
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Discussion
Células foram imobilizadas e padronizada dentro de substratos microgrooved em um dispositivo micro. O processo de apoptose de células expostas a peróxido de hidrogênio foi observada em tempo real e analisados utilizando anexina V e iodeto de propídio. Assim, este dispositivo micro contendo canais de Micro-poderia ser útil para high-throughput screening de drogas.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) |
| DMEM | medium | Invitrogen | 11965 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Media |
| FBS | serum | Invitrogen | 10082-147 | Fetal Bovine Serum |
| Hydrogen peroxide | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Apoptosis assay | Invitrogen | V13242 | Annexin A, propidium iodide | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 2015 | ||
| Si wafer | Tool | 4 inch silicone wafer | ||
| Reactive oxygen plasma | Reagent | Harrick Scientific Products, Inc. | treat wafer 5 min at 30W | |
| inverted microscope | Tool | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
- Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
- Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).
