Summary
Abbiamo descritto un protocollo per la fabbricazione di dispositivi microfluidici che può consentire la cattura delle cellule e della cultura. In questo approccio microstrutture modellata come scanalature all'interno dei canali microfluidica sono utilizzati per creare le regioni a basso sforzo di taglio all'interno del quale cellula possono attraccare.
Abstract
Descriviamo un dispositivo a microfluidi con modelli microgrooved per studiare il comportamento cellulare. Questa piattaforma microfluidica consiste in un canale superiore fluidico e un substrato di fondo microgrooved. Per fabbricare i canali microgrooved, un top poli (dimetilsiloxano) (PDMS) muffa contenente l'impressione dei canali microfluidica era allineato e legato ad un substrato microgrooved. Utilizzando questo dispositivo, le cellule di fibroblasti del mouse sono stati immobilizzati e fantasia all'interno di substrati microgrooved (25, 50, 75 e 100 micron di larghezza). Per studiare l'apoptosi in un dispositivo a microfluidi, supporti contenenti perossido di idrogeno, annessina V e ioduro di propidio è stato perfuso nel canale fluidico per 2 ore. Abbiamo trovato che le cellule esposte a stress ossidativo è diventato apoptotico. Queste cellule apoptotiche sono state confermate da annessina V che si lega alla fosfatidilserina al foglietto esterno della membrana plasmatica durante il processo di apoptosi. L'utilizzo di questo dispositivo a microfluidi con motivi microgrooved, il processo di apoptosi è stata osservata in tempo reale e analizzati utilizzando un microscopio invertito che contiene una camera di incubazione (37 ° C, 5% CO 2). Pertanto, questo dispositivo a microfluidi incorporato con substrati microgrooved potrebbe essere utile per studiare il comportamento cellulare e l'esecuzione di high-throughput screening di stupefacenti.
Protocol
Microfabrication A. del dispositivo a microfluidi
- 4-pollici wafer Si è trattata con plasma di ossigeno reattivo (5 min a 30 W, Harrick scientifico, NY).
- Photoresist negativo (SU-8 2015, MicroChem, MA) è spin-rivestito a 900 rpm per 1 minuto su un wafer di silicio.
- Il wafer è morbido al forno a 95 ° C per 6 minuti su una piastra ed è esposto alla luce UV (200W) per 4 minuti attraverso un film maschera contenente microcanali.
- Il wafer è post forno a 95 ° C per 6 minuti ed è stato sviluppato utilizzando SU-8 sviluppatore photoresist.
- Il wafer photoresist fantasia contenente microcanali è posto in un piatto di Petri-.
- Stampi poli (dimetilsiloxano) (PDMS) (Sylgard 184) sono fabbricati da elastomero di silicone di miscelazione e catalizzatore (10:1 ratio).
- La miscela PDMS si versa nello stampo e maestro Si è posto su un essiccatore a vuoto per rimuovere le bolle.
- PDMS è curata a 70 ° C per 1 ~ 2 ore.
- Stampi PDMS sono poi staccate dallo stampo maestro Si.
B. Montaggio del dispositivo
- 40 micron di spessore superiore canali fluidici e 40 micron di spessore inferiore canali microgrooved (25, 50, 75 e 100 μ m di larghezza) sono ottenuti da due diversi stampi Si maestro.
- Canale di ingresso e uscita del dispositivo fluidici sono perforate.
- Fluidico canali e canali microsolco sono irreversibilmente legati dal plasma di ossigeno reattivo (5 min a 30 W, Harrick scientifico, NY).
- Matrice extracellulare (ECM) (ossia fibronectina) è rivestito all'interno di dispositivo a microfluidi per 1 ora in incubatore (37 ° C).
C. semina cellulare e sperimentale
- NIH-3T3 fibroblasti di topo sono coltivate in un pallone di coltura di tessuti utilizzando Dulbecco Modified Eagle Media (DMEM) contenente 10% siero fetale bovino (FBS).
- Le cellule sono trypsinized e dissociato.
- Cellule dissociate vengono caricati nei canali microsolco alla densità cellulare di 3 × 10 6 cellule / ml (Figura 1).
Figura 1
- 2 media ml, 100 mm H 2 O 2, e il dosaggio apoptosi (20 microlitri annessina V e ioduro di propidio 40 microlitri, Invitrogen, CA) sono infuso in un canale utilizzando una pompa a siringa (1 ml / min).
- Le cellule sono monitorate in tempo reale utilizzando un microscopio invertito (Nikon TE 2000).
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Discussion
Le cellule sono state immobilizzate e fantasia all'interno di substrati microgrooved in un dispositivo a microfluidi. Il processo di apoptosi delle cellule esposte al perossido di idrogeno è stata osservata in tempo reale e analizzato utilizzando annessina V e ioduro di propidio. Quindi, questo dispositivo a microfluidi contenenti canali microsolco potrebbe essere utile per high-throughput screening di stupefacenti.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) |
| DMEM | medium | Invitrogen | 11965 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Media |
| FBS | serum | Invitrogen | 10082-147 | Fetal Bovine Serum |
| Hydrogen peroxide | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Apoptosis assay | Invitrogen | V13242 | Annexin A, propidium iodide | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 2015 | ||
| Si wafer | Tool | 4 inch silicone wafer | ||
| Reactive oxygen plasma | Reagent | Harrick Scientific Products, Inc. | treat wafer 5 min at 30W | |
| inverted microscope | Tool | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
- Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
- Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).
