Summary
Se describe un protocolo para la fabricación de dispositivos de microfluidos que puede permitir la captura de células y la cultura. En este enfoque micro modelado como ranuras dentro de los canales de microfluidos se utilizan para crear las regiones de baja tensión de corte dentro de la celda que se puede acoplar.
Abstract
Se describe un dispositivo de microfluidos con los patrones microgrooved para estudiar el comportamiento celular. Esta plataforma de microfluidos consiste en un canal superior de fluidos y un sustrato microgrooved fondo. Para la fabricación de los canales microgrooved, un alto poli (dimetilsiloxano) (PDMS) molde que contiene la impresión de los canales de microfluidos estaba alineado y unido a un sustrato microgrooved. El uso de este dispositivo, las células de fibroblastos de ratón fueron inmovilizados y modelado en sustratos microgrooved (25, 50, 75 y 100 de ancho micras). Para estudiar la apoptosis en un dispositivo de microfluidos, los medios de comunicación que contiene peróxido de hidrógeno, Annexin V y yoduro de propidio se perfundió en el canal de fluido durante 2 horas. Hemos encontrado que las células expuestas al estrés oxidativo se convirtió en la apoptosis. Estas células apoptóticas fueron confirmados por la anexina V, que unido a la fosfatidilserina en la hoja exterior de la membrana plasmática durante el proceso de apoptosis. El uso de este dispositivo de microfluidos con los patrones microgrooved, el proceso de apoptosis se observó en tiempo real y se analizaron mediante el uso de un microscopio invertido que contiene una cámara de incubación (37 ° C, 5% de CO 2). Por lo tanto, este dispositivo de microfluidos con sustratos incorporados microgrooved podría ser útil para el estudio del comportamiento celular y la realización de alto rendimiento de detección de drogas.
Protocol
A. microfabricación del dispositivo de microfluidos
- De 4 pulgadas de obleas de Si se trata con plasma de oxígeno reactivo (5 min a 30 W, Harrick Científico, NY).
- Fotosensible negativa (SU-8 2015, Microchem, MA) es spin-revestido a 900 rpm durante 1 minuto en una oblea de silicio.
- La oblea es suave al horno a 95 ° C durante 6 minutos en una placa calefactora y se expone a luz ultravioleta (200W) durante 4 minutos a través de una película que contiene la máscara de microcanales.
- La oblea es posterior al horno a 95 ° C durante 6 minutos y se desarrolla con SU-8 desarrollador fotosensible.
- La oblea fotosensible con dibujos que contienen microcanales se coloca en un plato de Petri.
- Moldes de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) (Sylgard 184) son fabricados por la mezcla de elastómero de silicona y agente de curado (10:1).
- La mezcla de PDMS se vierte sobre el molde maestro Si y se coloca en un desecador de vacío para eliminar las burbujas.
- PDMS se cura a 70 ° C durante 1 a 2 horas.
- Moldes PDMS luego se desprendió del molde maestro Si.
B. Montaje del dispositivo
- 40 micras de espesor superior canales fluidos y 40 micras de espesor inferior microgrooved canales (25, 50, 75 y 100 μ m de ancho) se obtienen a partir de dos moldes diferentes master Si.
- Canal de entrada y salida del dispositivo de fluidos se perforan.
- Canales fluidos y canales de microsurco están irreversiblemente unidos por el plasma de oxígeno reactivo (5 min a 30 W, Harrick Científico, NY).
- Matriz extracelular (MEC) (es decir, la fibronectina) está recubierto en el interior del dispositivo de microfluidos durante 1 hora en la incubadora (37 ° C).
C. siembra de células y la instalación experimental
- NIH-3T3 fibroblastos de ratón se cultivaron en un frasco de cultivo de tejidos utilizando los medios de comunicación Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS).
- Las células se trypsinized y disociado.
- Las células disociadas se cargan en los canales de microsurco en la densidad celular de 3 × 10 6 células / ml (Figura 1).
Figura 1
- 2 ml de medio, 100 mM H 2 O 2, y el ensayo de la apoptosis (20 l Annexin V y yoduro de propidio 40 l, Invitrogen, CA) se infunden en un canal utilizando una bomba de jeringa (1 l / min).
- Las células son monitoreados en tiempo real mediante el uso de un microscopio invertido (Nikon TE 2000).
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Discussion
Las células fueron inmovilizados y modelado en sustratos microgrooved en un dispositivo de microfluidos. El proceso de la apoptosis de las células expuestas al peróxido de hidrógeno se observó en tiempo real y se analizaron mediante el uso de anexina V y yoduro de propidio. Así, este dispositivo de microfluidos que contienen canales de microsurco podría ser útil para la detección de drogas de alto rendimiento.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) |
| DMEM | medium | Invitrogen | 11965 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Media |
| FBS | serum | Invitrogen | 10082-147 | Fetal Bovine Serum |
| Hydrogen peroxide | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Apoptosis assay | Invitrogen | V13242 | Annexin A, propidium iodide | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 2015 | ||
| Si wafer | Tool | 4 inch silicone wafer | ||
| Reactive oxygen plasma | Reagent | Harrick Scientific Products, Inc. | treat wafer 5 min at 30W | |
| inverted microscope | Tool | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
- Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
- Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).
