Summary
我们描述了一种用于制造微流体装置，可以使细胞的捕获和文化协议。在这种方法中，如微流体通道内的沟槽图案的微观结构是用来建立低剪切应力区域内的细胞可以停靠。
Abstract
我们描述了一个微流体装置与microgrooved模式，研究细胞行为。这种微流体平台包括一个顶级的流体通道和自下而上microgrooved基板。编造microgrooved渠道，一个顶级的聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具包含微流体通道的印象是对齐和粘结到microgrooved基板。使用这种设备，小鼠成纤维细胞被固定在microgrooved基板图案（25，50，75，宽100微米）。为了研究细胞凋亡在微流体装置，介质中含有过氧化氢，膜联蛋白V和碘化丙啶灌注到2小时的流体通道。我们发现，暴露在氧化应激的细胞变得凋亡。通过Annexin V结合在细胞凋亡过程中的质膜外单张磷脂酰证实这些细胞凋亡。 microgrooved模式使用这种微流体装置，细胞凋亡过程中实时观察，并包含一个孵化室（37℃，5％的CO 2）使用倒置显微镜分析。因此，这microgrooved基板中的微流体装置可用于研究细胞行为和进行高通量药物筛选。
Protocol
A.微流体装置的微细加工
- 4英寸硅片的处理与活性氧离子（Harrick科学30W，5分钟，NY）。
- 负型光刻胶（SU - 8 2015年，Microchem，MA）是在一个硅晶片上的1分钟900转的旋涂。
- 晶圆是软烤95℃，在烤盘6分钟，通过一个面罩含微膜4分钟，以紫外灯（200W）。
- 晶圆是出炉后在95℃，6分钟和开发利用SU - 8光刻胶开发。
- 含微的光致抗蚀剂图形晶片被放置在一个Petri盘。
- 聚二甲基硅氧烷（PDMS）中（Sylgard 184）模具制造混合的有机硅弹性体和固化剂（10:1）。
- PDMS的混合物倒入四母模，放在真空干燥器，以消除泡沫。
- PDMS的是固化在70 ° C，1〜2小时。
- 硅橡胶模具，然后从四母模揭下。
B.组装设备
- 从两个不同的四掌握模具获得40微米厚的顶部流体通道和40微米厚的底部microgrooved通道（25，50，75和100μm宽）。
- 通道的入口和流体设备的电源插座是拳打脚踢。
- 流体的渠道和细纹渠道是不可逆的保税的活性氧等离子（Harrick科学30W，5分钟，纽约州）。
- 微流体装置内涂外基质（ECM）（即纤维连接蛋白）的培养箱中培养1小时（37℃）。
C.细胞种植和实验装置
- NIH - 3T3小鼠成纤维细胞培养使用贝科改良Eagle的媒体（DMEM），含10％胎牛血清（FBS），在组织文化烧瓶。
- 细胞胰酶消化分离。
- 游离细胞装入细胞密度3 × 10 6细胞/ ml（图1）细纹渠道。
图1
- 使用注射泵（1μL/分钟）的通道注入2毫升媒体，100毫米的H 2 O 2，检测细胞凋亡（20μLAnnexin V和40μL的碘化丙啶，Invitrogen公司，CA ）。
- 细胞是实时监测，通过倒置显微镜（尼康TE的2000）。
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Discussion
细胞固定，并在microgrooved基板图案中的微流体装置。暴露在过氧化氢的细胞凋亡过程中实时观察和分析，通过Annexin V和碘化丙啶。因此，这种微流体装置，包含细纹渠道，可用于高通量药物筛选。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) |
| DMEM | medium | Invitrogen | 11965 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Media |
| FBS | serum | Invitrogen | 10082-147 | Fetal Bovine Serum |
| Hydrogen peroxide | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Apoptosis assay | Invitrogen | V13242 | Annexin A, propidium iodide | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 2015 | ||
| Si wafer | Tool | 4 inch silicone wafer | ||
| Reactive oxygen plasma | Reagent | Harrick Scientific Products, Inc. | treat wafer 5 min at 30W | |
| inverted microscope | Tool | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
- Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
- Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).
