Summary
Nous décrivons un protocole pour la fabrication de dispositifs microfluidiques qui peut permettre la capture cellulaire et de culture. Dans cette approche microstructures motifs tels que des rainures dans les canaux microfluidiques sont utilisés pour créer les régions à faible contrainte de cisaillement dans lequel la cellule peut quai.
Abstract
Nous décrivons un dispositif microfluidique avec des motifs microgrooved pour étudier le comportement cellulaire. Cette plate-forme microfluidique est constitué d'un canal supérieur fluidique et un substrat inférieur microgrooved. Pour fabriquer les canaux microgrooved, un sommet du poly (diméthylsiloxane) (PDMS) moule contenant l'empreinte de la canaux microfluidiques a été aligné et collé à un substrat microgrooved. En utilisant ce dispositif, les cellules de fibroblastes de souris ont été immobilisées et modelée au sein des substrats microgrooved (25, 50, 75 et 100 um de large). Pour étudier l'apoptose dans un dispositif microfluidique, des milieux contenant du peroxyde d'hydrogène, l'annexine V et l'iodure de propidium a été perfusé dans le canal fluidique pendant 2 heures. Nous avons constaté que les cellules exposées au stress oxydatif est devenu apoptotiques. Ces cellules apoptotiques ont été confirmés par l'annexine V qui liait à la phosphatidylsérine dans le feuillet externe de la membrane plasmique au cours du processus d'apoptose. L'utilisation de ce dispositif microfluidique avec des motifs microgrooved, le processus d'apoptose a été observée en temps réel et analysées en utilisant un microscope inversé contenant une chambre d'incubation (37 ° C, 5% CO 2). Par conséquent, ce dispositif microfluidique intégré avec des substrats microgrooved pourrait être utile pour étudier le comportement cellulaire et l'exécution de dépistage de drogues à haut débit.
Protocol
A. microfabrication du dispositif microfluidique
- 4-inch wafer silicium est traitée avec du plasma d'oxygène réactif (5 min à 30W, Harrick scientifique, NY).
- Photoresist négatif (SU-8 2015, Microchem, MA) est spin-couché à 900 rpm pendant 1 min sur un wafer de silicium.
- La plaquette est douce cuit à 95 ° C pendant 6 minutes sur une plaque chauffante et est exposée à la lumière UV (200W) pendant 4 min à travers un film masque contenant des microcanaux.
- La plaquette est post cuit à 95 ° C pendant 6 min et est développé en utilisant SU-8 développeur résine photosensible.
- La plaquette photorésine motifs contenant des microcanaux est placé dans une boîte de Petri.
- Moules de poly (diméthylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) sont fabriqués par élastomère de silicone de mélange et de durcisseur (10:1).
- Le mélange PDMS est versé sur le moule maître Si et est placé sur un dessiccateur à vide pour enlever les bulles.
- PDMS est guéri à 70 ° C pendant 1 ~ 2 heures.
- Moules en PDMS sont ensuite décollée du moule maître de silicium.
B. Assemblage du dispositif de
- 40 um d'épaisseur supérieure canaux fluidiques et 40 um canaux fond épais microgrooved (25, 50, 75 et 100 μ m de large) sont obtenus à partir de deux différents moules maître de silicium.
- Entrée du canal et la sortie du dispositif fluidique sont perforées.
- Canaux fluidiques et des canaux de microsillons sont irréversiblement liés par le plasma d'oxygène réactif (5 min à 30W, Harrick scientifique, NY).
- Matrice extracellulaire (MEC) (ie la fibronectine) est enduit intérieur de dispositif microfluidique pendant 1 heure dans un incubateur (37 ° C).
L'ensemencement de cellules C, et dispositif expérimental
- Fibroblastes de souris NIH-3T3 sont cultivés dans un flacon de culture de tissus en utilisant les médias Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS).
- Les cellules sont trypsinisées et dissociés.
- Les cellules dissociées sont chargés dans les canaux de microsillons à la densité cellulaire de 3 × 10 6 cellules / ml (figure 1).
Figure 1
- 2 médias ml, 100 mm H 2 O 2, et le dosage apoptose (20 uL annexine V et l'iodure de propidium 40 uL, Invitrogen, CA) sont infusés dans un canal à l'aide d'une seringue électrique (1 pi / min).
- Les cellules sont surveillées en temps réel en utilisant un microscope inversé (Nikon TE 2000).
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Discussion
Les cellules ont été immobilisées et modelée dans les substrats microgrooved dans un dispositif microfluidique. Le processus d'apoptose des cellules exposées au peroxyde d'hydrogène a été observé en temps réel et analysées en utilisant l'annexine V et l'iodure de propidium. Ainsi, ce dispositif microfluidique contenant des canaux microsillons pourrait être utile pour le dépistage de drogue à haut débit.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) |
| DMEM | medium | Invitrogen | 11965 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Media |
| FBS | serum | Invitrogen | 10082-147 | Fetal Bovine Serum |
| Hydrogen peroxide | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Apoptosis assay | Invitrogen | V13242 | Annexin A, propidium iodide | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 2015 | ||
| Si wafer | Tool | 4 inch silicone wafer | ||
| Reactive oxygen plasma | Reagent | Harrick Scientific Products, Inc. | treat wafer 5 min at 30W | |
| inverted microscope | Tool | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
- Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
- Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).
