Summary
אנו מתארים פרוטוקול עבור ייצור של מכשירים microfluidic שיכולה לאפשר לכידת תא ותרבות. בגישה זו microstructures בדוגמת כגון חריצים בתוך ערוצי microfluidic המשמשים ליצירת מתח נמוך גזירה אזורים בתוך התא שבו ניתן לעגן.
Abstract
אנו מתארים מכשיר microfluidic עם דפוסי microgrooved לחקר התנהגות תאית. זו פלטפורמה microfluidic מורכבת ערוץ fluidic העליון מצע microgrooved התחתונה. כדי לפברק את ערוצי microgrooved, העליון פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) עובש המכיל את הרושם של ערוצי microfluidic היה בציר קשור מצע microgrooved. שימוש במכשיר זה, תאים פיברובלסטים עכבר היו משותק בתוך מצעים בדוגמת microgrooved (25, 50, 75, ו - 100 מיקרומטר רחב). כדי ללמוד אפופטוזיס במכשיר microfluidic, מדיה המכילה מי חמצן, Annexin V, יודיד propidium היה perfused לתוך התעלה fluidic למשך 2 שעות. מצאנו כי תאים שנחשפו ללחץ חמצוני הפך אפופטוטיים. תאים אפופטוטיים אלה אושרו על ידי Annexin V כי חייב phosphatidylserine על עלון החיצוני של קרום התא בעת תהליך אפופטוזיס. שימוש המכשיר microfluidic עם דפוסי microgrooved, תהליך אפופטוזיס נצפתה בזמן אמת ונותחו באמצעות מיקרוסקופ הפוך הכולל תא הדגירה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). לכן, זה מכשיר microfluidic משולב עם מצעים microgrooved יכול להיות שימושי עבור לימוד התנהגות הסלולר וביצוע תפוקה גבוהה ההקרנה סמים.
Protocol
א Microfabrication של המכשיר microfluidic
- 4 אינץ' רקיק סי מטופל עם פלזמה החמצן מגיב (5 דקות ב 30W, Harrick מדעי, ניו יורק).
- Photoresist שלילית (SU-8 2015, Microchem, MA) היא ספין מצופה בסל"ד 900 דקות 1 על פרוסות סיליקון Si.
- רקיק הוא רך אפוי על 95 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות על פלטה חמה, והוא נחשף לאור UV (200W) עבור 4 דקות דרך הסרט מסכה המכילה microchannels.
- רקיק הוא שלאחר אפוי על 95 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות, והוא פותח באמצעות SU-8 מפתח photoresist.
- רקיק בדוגמת photoresist המכיל microchannels מושם בצלחת פטרי,.
- תבניות פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) מיוצרים על ידי אלסטומר סיליקון ערבוב סוכן ריפוי (יחס 10:01).
- התערובת PDMS הוא שפך על עובש האב Si ו מושם על ייבוש ואקום כדי להסיר בועות.
- PDMS נירפאים ב 70 ° C עבור 1 ~ 2 שעות.
- תבניות PDMS הם קלופים אז מן עובש האב סי.
ב הרכבת המכשיר
- 40 ערוצי מיקרומטר עבה fluidic העליון 40 מיקרומטר ערוצי תחתית עבה microgrooved (25, 50, 75, ו - 100 מ 'μ רחב) מתקבלים משתי תבניות שונות סי מאסטר.
- כניסת ערוץ לשקע של המכשיר fluidic הם אגרוף.
- ערוצי Fluidic ערוצי microgroove מודבקים באופן בלתי הפיך על ידי הפלזמה החמצן מגיב (5 דקות ב 30W, Harrick מדעי, ניו יורק).
- תאי מטריקס (ECM) (כלומר פיברונקטין) מצופה בתוך המכשיר microfluidic שעה 1 ב בחממה (37 ° C).
ג זריעת תאים התקנה ניסיונית
- NIH-3T3 fibroblasts העכבר הם בתרבית רקמה בבקבוק תרבות באמצעות מדיה השתנה Dulbecco הנשר של (DMEM) המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS).
- תאים הם trypsinized ו ניתק.
- תאים ניתק נטענים לתוך תעלות microgroove בצפיפות התא של 3 × 10 6 תאים / מ"ל (איור 1).
איור 1
- 2 מדיה מ"ל, 100 מ"מ H 2 O 2, ו assay אפופטוזיס (20 μL Annexin V ו 40 יודיד propidium μL, Invitrogen, CA) הם החדיר לתוך ערוץ באמצעות משאבת מזרק (1 μl / min).
- תאים הם בזמן אמת פיקוח באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (ניקון TE 2000).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תאים היו משותק בתוך מצעים בדוגמת microgrooved במכשיר microfluidic. תהליך אפופטוזיס של תאים שנחשפו מי חמצן נצפתה בזמן אמת ונותחו באמצעות Annexin V ו יודיד propidium. לכן, זה מכשיר microfluidic המכיל ערוצי microgroove יכול להיות שימושי עבור הקרנת תפוקה גבוהה סמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) |
| DMEM | medium | Invitrogen | 11965 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Media |
| FBS | serum | Invitrogen | 10082-147 | Fetal Bovine Serum |
| Hydrogen peroxide | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Apoptosis assay | Invitrogen | V13242 | Annexin A, propidium iodide | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 2015 | ||
| Si wafer | Tool | 4 inch silicone wafer | ||
| Reactive oxygen plasma | Reagent | Harrick Scientific Products, Inc. | treat wafer 5 min at 30W | |
| inverted microscope | Tool | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
- Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
- Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).
