Summary
Vi beskriver ett protokoll för tillverkning av mikroflödessystem enheter som kan aktivera cellen fånga och kultur. I denna strategi mönstrade mikrostrukturer som spår inom mikroflödessystem kanaler används för att skapa regioner med låg skjuvspänningen inom vilken cell kan docka.
Abstract
Vi beskriver en mikroflödessystem enhet med mikrokanalernas mönster för att studera cellulära beteende. Detta mikroflödessystem Plattformen består av en topp fluidic kanal och en botten mikrokanalernas substrat. Att fabricera mikrokanalernas kanaler, var en topp poly (dimetylsiloxan) (PDMS) mögel som innehåller den bild av mikroflödessystem kanaler linje och bunden till en mikrokanalernas substrat. Med hjälp av denna enhet, var musen fibroblast celler stoppas och mönstrade inom mikrokanalernas substrat (25, 50, 75 och 100 ìm bred). Att studera apoptos i en mikroflödessystem enhet, var media som innehåller väteperoxid, Annexin V och propidiumjodid perfusion i fluidic kanal för 2 timmar. Vi fann att celler som utsätts för oxidativ stress blev apoptotiska. Dessa apoptotiska celler bekräftades av Annexin V som bundna till fosfatidylserin vid den yttre bipacksedel plasmamembran under apoptos processen. Med denna mikroflödessystem enhet med mikrokanalernas mönster var apoptos processen observerats i realtid och analyseras med hjälp av ett inverterat mikroskop med en inkubation kammare (37 ° C, 5% CO 2). Därför kunde detta mikroflödessystem enhet inbyggd med mikrokanalernas substrat vara användbart för att studera de cellulära beteenden och utför med hög genomströmning drog screening.
Protocol
A. mikrofabrikation av mikroflödessystem enhet
- 4-tums Si wafer behandlas med reaktivt syre plasma (5 min på 30W, Harrick Scientific, NY).
- Negativ fotoresist (SU-8 2015, Microchem, MA) är spin-belagd vid 900 rpm i 1 minut på en Si wafer.
- Skivan är mjuk bakas vid 95 ° C under 6 min på en värmeplatta och utsätts för UV-ljus (200W) i 4 min genom en mask film som innehåller mikrokanaler.
- Skivan är post bakas vid 95 ° C i 6 min och är utvecklat med hjälp av SU-8 fotoresist utvecklare.
- Den fotoresist mönstrade wafer innehåller mikrokanaler placeras i en Petri-skål.
- Poly (dimetylsiloxan) (PDMS) (Sylgard 184) formar tillverkas genom att blanda silikon elastomer och härdare (10:1 förhållande).
- Den PDMS Blandningen hälls ut på Si mästare mögel och placeras på en vakuumexsickator att ta bort bubblor.
- PDMS är härdad vid 70 ° C under 1 ~ 2 timmar.
- PDMS formar sedan skalas av från Si mästare mögel.
B. Montering av enheten
- 40 ìm tjock topp fluidic kanaler och 40 ìm tjock botten mikrokanalernas kanaler (25, 50, 75 och 100 μ m bred) erhålls från två olika Si mästare formar.
- Kanal inlopp och utlopp fluidic enheten är stansade.
- Fluidic kanaler och kanaler MIKROSPÅR är irreversibelt bundna av reaktivt syre plasma (5 min på 30W, Harrick Scientific, NY).
- Extracellulär matrix (ECM) (dvs fibronektin) är belagd inuti mikroflödessystem enhet för en timme i kuvös (37 ° C).
C. Cell sådd och experiment
- NIH-3T3 musfibroblaster odlas i en vävnadsodling kolv med Dulbecco ändrade Eagles Media (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS).
- Celler är trypsinized och dissocierade.
- Dissocierade celler laddas in i MIKROSPÅR kanaler på celltäthet av 3 × 10 6 celler / ml (figur 1).
Figur 1
- 2 ml medier, 100 mm H 2 O 2, och apoptos analys (20 mikroliter Annexin V och 40 mikroliter propidiumjodid, Invitrogen, CA) är infunderas i en kanal med en sprutpump (1 l / min).
- Cellerna i realtid övervakas med hjälp av ett inverterat mikroskop (Nikon TE 2000).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Celler var immobiliserade och mönstrade inom mikrokanalernas substrat i en mikroflödessystem enhet. Den apoptos process av celler som utsätts för väteperoxid observerades i realtid och analyseras med hjälp av Annexin V och propidiumjodid. Således kan detta mikroflödessystem enhet som innehåller MIKROSPÅR kanaler vara användbara för high-throughput drog screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) |
| DMEM | medium | Invitrogen | 11965 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Media |
| FBS | serum | Invitrogen | 10082-147 | Fetal Bovine Serum |
| Hydrogen peroxide | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Apoptosis assay | Invitrogen | V13242 | Annexin A, propidium iodide | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 2015 | ||
| Si wafer | Tool | 4 inch silicone wafer | ||
| Reactive oxygen plasma | Reagent | Harrick Scientific Products, Inc. | treat wafer 5 min at 30W | |
| inverted microscope | Tool | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
- Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
- Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).
