Summary
Biz hücre yakalama ve kültür etkinleştirebilirsiniz mikroakışkan cihazların imalatı için bir protokol tanımlamaktadır. Bu yaklaşımda, mikroakışkan kanallar içinde oluk gibi desenli mikro, içinde hücre sabitleyebilirsiniz Shear stresin düşük olduğu bölgelerde oluşturmak için kullanılır.
Abstract
Biz hücresel davranış eğitimi için microgrooved desenleri ile bir mikroakışkan cihaz açıklar. Bu mikroakışkan platformda üst akışkan bir kanal ve bir alt microgrooved substrat oluşur. Microgrooved kanalları imal etmek için, mikroakışkan kanalları izlenim içeren bir üst poli (dimethylsiloxane) (PDMS) kalıp hizalanmış ve microgrooved bir yüzeye yapıştırılır. Bu cihazı kullanarak, fare fibroblast hücreleri (25, 50, 75, ve 100 mm genişliğinde) immobilize ve microgrooved substratlar içinde desenli. Mikroakışkan bir cihaz apoptozis çalışmak için 2 saat boyunca akışkan kanal içine hidrojen peroksit, Annexin V ve propidium iyodür içeren medya perfüze edildi. Biz oksidatif strese maruz kalan hücrelerin apoptotik oldu bulundu. Bu apoptotik hücreler apopitoz işlemi sırasında plazma membranı dış broşüre fosfatidilserin bağlı Annexin V tarafından teyit edildi. Mikroakışkan microgrooved desenleri ile bu cihazı kullanarak, apoptozis sürecini gerçek zamanlı olarak gözlenen ve bir kuluçka odası (37 ° C,% 5 CO 2) içeren bir inverted mikroskop kullanılarak analiz edildi. Bu nedenle, microgrooved substratları dahil bu mikroakışkan cihaz hücresel davranış eğitimi ve yüksek verimli bir ilaç tarama yapmak için yararlı olabilir.
Protocol
Mikroakışkan cihazın A. mikroimalat
- 4-inç Si levhası, reaktif oksijen plazma (30W, harrick Bilimsel az 5 dakika, NY) ile tedavi edilir.
- Negatif fotorezist (SU-8 2015, Microchem, MA) Si gofret 1 dakika için 900 rpm spin-kaplı.
- Gofret yumuşak, 95 pişirilmiş ° C, bir ocak 6 dk ve mikro içeren bir maske filmi ile 4 dakika UV ışığı (200W) maruz kalmaktadır.
- Gofret 95 pişmiş yazılan ° C 6 dakika süreyle ve SU-8 fotorezist geliştirici kullanılarak geliştirilmiştir.
- Petri kabı içerisinde mikro içeren desenli paslanmaz çeliğin gofret yerleştirilir.
- Poli (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) kalıplar, karıştırma silikon elastomer ve sertleştirici (10:1 oranı) tarafından imal edilir.
- PDMS karışımı Si ana kalıp üzerine dökülür ve kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum desikatörde yerleştirilir.
- PDMS 1 ~ 2 saat boyunca 70 ° C'de kür.
- PDMS kalıpları sonra Si ana kalıptan sıyrılır.
B. cihaz ve Montajı
- 40 mikron kalınlığında üst akışkan kanalları ve 40 mikron kalınlığında alt microgrooved kanalları (25, 50, 75, ve μ 100 m genişliğinde), iki farklı Si ana kalıplar elde edilir .
- Kanal akışkan cihaz giriş ve çıkış delikli.
- Akışkan kanalları ve devirli plâktaki incecik kanalları geri dönüşümsüz reaktif oksijen plazma (30W, harrick Bilimsel az 5 dakika, NY) ile yapıştırılır.
- Ekstrasellüler matriks (ECM), (yani fibronektin) 1 saat inkübatör (37 ° C) için mikroakışkan cihazın içinde kaplanmıştır.
C. Hücre tohumlama ve deney düzeneği
- NIH-3T3 fare fibroblastlar% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Media (DMEM) kullanarak doku kültürü şişesi kültür.
- Hücreler tripsinize ve ayrışmış.
- Disosiye hücreleri hücre yoğunluğu 3 × 10 6 hücre / ml (Şekil 1) devirli plâktaki incecik kanallar içine yüklenir.
Şekil 1
- 2 mL medya, 100 mM H 2 O 2 ve apoptozis assay (20 mcL Annexin V ve 40 mcL propidium iyodür, Invitrogen, CA) bir şırınga pompası (1 ul / dk) ile bir kanal içine infüze.
- Hücreler gerçek zamanlı ters bir mikroskop kullanılarak (Nikon TE 2000) tarafından izlenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücreler mikroakışkan bir cihaz microgrooved substratlar içinde hareketsiz ve desenli. Hidrojen peroksit maruz kalan hücrelerin apoptozis sürecini gerçek zamanlı olarak gözlenen ve Annexin V ve propidium iyodür kullanılarak analiz edildi. Böylece, devirli plâktaki incecik kanalları içeren bu mikroakışkan cihaza, yüksek verimli ilaç tarama için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) |
| DMEM | medium | Invitrogen | 11965 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Media |
| FBS | serum | Invitrogen | 10082-147 | Fetal Bovine Serum |
| Hydrogen peroxide | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Apoptosis assay | Invitrogen | V13242 | Annexin A, propidium iodide | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 2015 | ||
| Si wafer | Tool | 4 inch silicone wafer | ||
| Reactive oxygen plasma | Reagent | Harrick Scientific Products, Inc. | treat wafer 5 min at 30W | |
| inverted microscope | Tool | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
- Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
- Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).
