In vivo imaging af Mouse Spinal Cord ved hjælp af to-foton mikroskopi
Summary
Et minimalt invasiv protokol til at stabilisere musen rygsøjlen og udføre gentagne<em> In vivo</em> Rygmarven billeddannelse ved hjælp af to-foton mikroskopi er beskrevet. Denne metode kombinerer en spinal stabilisering enhed og anæstesiregimet at minimere åndedræts-inducerede bevægelser og producerer rå billeddata, som ikke kræver justering eller anden efterbehandling.
Abstract
In vivo imaging ved hjælp af to-foton mikroskopi 1 i mus, der er genetisk manipuleret til at udtrykke fluorescerende proteiner i bestemte celletyper 2-3 er blevet væsentligt udvidet vores viden om fysiologiske og patologiske processer i talrige væv in vivo 4-7. I studier af det centrale nervesystem (CNS), har der været en bred anvendelse af in vivo imaging i hjernen, som har produceret et væld af nye og ofte uventede resultater om opførslen af celler som neuroner, astrocytes, mikroglia, under fysiologiske eller patologiske tilstande 8-17. Imidlertid har det meste tekniske komplikationer begrænsede gennemførelse af in vivo billeddannelse i studier af den levende mus rygmarven. I særdeleshed genererer anatomiske nærhed af rygmarven til lungerne og hjertet betydelig bevægelse artefakt, der gør billedbehandling den levende rygmarven en udfordrende opgave. </p>
Vi har udviklet en ny metode, der overvinder de iboende begrænsninger i rygmarven imaging ved at stabilisere rygsøjlen, reducere luftvejs-inducerede bevægelser og dermed fremme brugen af to-foton mikroskopi til billede musen rygmarven in vivo. Dette opnås ved at kombinere en skræddersyet spinal stabilisering enhed med en metode til dyb anæstesi, hvilket resulterer i en betydelig reduktion af luftvejs-induceret bevægelser. Denne video-protokollen viser, hvordan du kan udsætte et lille område af den levende rygmarven, der kan vedligeholdes under stabile fysiologiske forhold over længere perioder ved at holde vævsskade og blødning til et minimum. Repræsentant rå billeder erhvervet in vivo detaljer i høj opløsning den tætte sammenhæng mellem mikroglia og kar. En timelapse sekvens viser den dynamiske adfærd microglial processer i levende mus rygmarven. Desuden en kontinuerlig scanning af samme z-frame demonstreres enestående stabilitet, at denne metode kan nå at generere stakke af billeder og / eller timelapse film, der ikke kræver billede styremærket-købet. Endelig vil vi vise, hvordan denne metode kan bruges til at vende tilbage til og Reimage det samme område af rygmarven på senere tidspunkter, der giver mulighed for longitudinelle studier af igangværende fysiologiske eller patologiske processer in vivo.
Protocol
Discussion
Metoden beskrevet her giver mulighed for stabile og gentagne in vivo billeddannelse af tætbefolkede fluorescerende cellulære strukturer i rygmarv fra bedøvet mus ved hjælp af to-foton mikroskopi. Den opnåede stabilitet er et resultat af et skræddersyet spinal stabilisering enhed og anæstesiregimet, som reducerer åndedræts-induceret bevægelse artefakt. Det spinal stabilisering enhed giver pusterum under musen kroppen og kan opbygges ved hjælp af kommercielt tilgængelige spinal klemmer og hoved monter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Scleroseforeningen give RG4595A1 / T til DD og NIH / NINDS stipendier NS051470, NS052189 og NS066361 til KA Tal og film tilpasset og / eller genoptrykt fra Davalos et al., J Neurosci Metoder. 2008 Marts 30, 169 (1) :1-7 Copyright 2008, med tilladelse fra Elsevier.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluted in ACSF (3% w/v) |
| Ketamine HCl | Bionichepharma | NDC No: 67457-001-10 | Injectable, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd Labs | NADA No: 139-236 | Xylazine injectable, 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco | NADA No: 117-531 | Injectable,10mg/ml |
| Artificial tears ointment |
Phoenix pharmaceutical |
NDC No: 57319-760- 25 |
Lubricant |
| Betadine | Fisher | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Scissors |
World Precision Instruments |
555500S | Curved, blunt-tip scissors |
| Straight Forceps | World Precision Instruments |
555047FT | Toothed tip forceps |
| Small vessel cauterize | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia,Pfizer Inc. | Mixer Mill MM400 | |
| Compact spinal cord clamps |
Narishige | STS-A | |
| Head holding adaptor | Narishige | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham Biosciences Corp. |
80-6421-43 | |
| Lactated Ringers | Baxter Healthcare | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc. |
NDC No: 12496- 6757-1 |
Buprenorphine, injectable |
| Baytril | Bayer | NADA 140-913 | Enrofloxacin, antibacterial injectable 2.27% (20ml) |
| Heating pad – Large | Fine Science Tools | 21060-10 |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420, 812-816 (2002).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385, 161-165 (1997).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Wang, X. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
- Christie, R. H. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer’s disease observed by in vivo multiphoton microscopy. J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer’s disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).
- Jung, S. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat. Med. 11, 572-577 (2005).
- Kim, J. V. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med. 203, 505-511 (2006).
- Lindquist, R. L. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).
- Schwickert, T. A. vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure. Nature. 446, 83-87 (2007).
