Summary

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

Published: January 05, 2012
doi:

Summary

بروتوكول مينيملي لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري وأداء الماوس المتكررة<em> في الجسم الحي</emيوصف> تصوير الحبل الشوكي باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. هذا الأسلوب يجمع بين جهاز تثبيت العمود الفقري ونظام للحد من مخدر الجهاز التنفسي التي يسببها الحركات وإنتاج بيانات التصوير الخام التي لا تحتاج إلى محاذاة أو غيرها في مرحلة ما بعد المعالجة.

Abstract

في الجسم الحي التصوير باستخدام اثنين من الفوتون المجهري 1 في الفئران التي تمت هندستها وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية في أنواع الخلايا المحددة 2-3 اتسع بشكل ملحوظ معرفتنا العمليات الفسيولوجية والمرضية في أنسجة عديدة في الجسم الحي 4-7. في دراسات الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، كان هناك تطبيق واسع النطاق في مجال التصوير من المجراة في الدماغ ، الذي أنتج مجموعة كبيرة من النتائج غير المتوقعة والرواية كثيرا عن سلوك من الخلايا مثل الخلايا العصبية ، الخلايا النجمية ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، في إطار ظروف فيزيولوجية أو مرضية 17/08. ومع ذلك ، فقد التعقيدات التقنية محدودة معظمها في تنفيذ التصوير في الدراسات المجراة الذين يعيشون الحبل الشوكي الماوس. على وجه الخصوص ، على مقربة التشريحية من الحبل الشوكي إلى الرئتين والقلب الكبير يولد حركة القطع الأثرية التي تجعل من تصوير الحبل الشوكي المعيشة مهمة صعبة. </P>

طورنا أسلوب الرواية التي يتغلب على القيود المتأصلة في تصوير الحبل الشوكي عن طريق تثبيت العمود الفقري ، والحد من الجهاز التنفسي التي يسببها الحركات وبالتالي تيسير استخدام ثنائي الفوتون المجهري لصورة الحبل الشوكي الماوس في الجسم الحي. ويتحقق ذلك من خلال الجمع بين جهاز مخصص لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري مع وسيلة لتخدير عميق ، مما أدى إلى انخفاض كبير في الجهاز التنفسي التي يسببها الحركات. هذا البروتوكول فيديو يوضح كيفية كشف مساحة صغيرة من الحبل الشوكي الحية التي لا يمكن الحفاظ عليه في ظل الظروف الفسيولوجية مستقرة على مدى فترات طويلة من الزمن عن طريق الحفاظ على إصابة الأنسجة والنزيف إلى أدنى حد ممكن. الحصول على الصور الخام ممثل بالتفصيل المجراة في ارتفاع القرار على العلاقة الوثيقة بين الأوعية الدموية والخلايا الدبقية الصغيرة في. تسلسل timelapse يوضح السلوك الديناميكي للعمليات دبقية صغيرة تعيش في الحبل الشوكي الماوس. علاوة على ذلك ، تفحص المستمر من الإطار – Z إثبات نفسهق استقرار المعلقة أن هذا الأسلوب يمكن أن يحقق لتوليد اكوام من الصور و / أو الأفلام timelapse التي لا تتطلب محاذاة صورة ما بعد الاستحواذ. أخيرا ، وتبين لنا كيف يمكن استخدام هذه الطريقة لإعادة النظر في وreimage نفس المنطقة من الحبل الشوكي في timepoints في وقت لاحق ، مما يسمح للدراسات طولية من العمليات الجارية فيزيولوجية أو مرضية في الجسم الحي.

Protocol

1. بناء جهاز تثبيت العمود الفقري النظام STS – A Narishige ضغط المشابك الحبل الشوكي وMA – 6N Narishige عقد رئيس المحول. العرف تصميم وصنع قاعدة الفولاذ المقاوم للصدأ لوحة لعقد جزأين Narishige في محاذاة بحيث يتم ا?…

Discussion

الطريقة الموضحة هنا يسمح مستقرة ومتكررة في مجال التصوير فيفو الهياكل ذات الكثافة السكانية العالية الخلوية فلوري في النخاع الشوكي للفئران تخدير باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. والاستقرار الذي تحقق هو نتيجة لجهاز صنعت خصيصا لتحقيق الاستقرار في العمود ا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل عن طريق التصلب المتعدد في الجمعية الوطنية منح RG4595A1 / T لDD ومنح المعاهد الوطنية للصحة / NINDS NS051470 ، وNS052189 NS066361 إلى أرقام KA تكييفها والأفلام و / أو إعادة طبعها من دافالوس وآخرون ، J طرق Neurosci. 2008 مارس 30 ؛ 169 (1) :1 – 7 حقوق التأليف والنشر عام 2008 ، بإذن من السيفير.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Rhodamine B dextran Invitrogen D1841 70 kDa, diluted in
ACSF (3% w/v)
Ketamine HCl Bionichepharma NDC No: 67457-001-10 Injectable, 50mg/ml
Anased Lloyd Labs NADA No: 139-236 Xylazine injectable,
20mg/ml
Acepromazine Vedco NADA No: 117-531 Injectable,10mg/ml
Artificial tears
ointment
Phoenix
pharmaceutical
NDC No: 57319-760-
25
Lubricant
Betadine Fisher 19-061617  
McPherson-Westcott
Scissors
World Precision
Instruments
555500S Curved, blunt-tip
scissors
Straight Forceps World Precision
Instruments
555047FT Toothed tip forceps
Small vessel cauterize Fine Science Tools 18000-00  
Gelfoam Pharmacia,Pfizer Inc. Mixer Mill MM400  
Compact spinal cord
clamps
Narishige STS-A  
Head holding adaptor Narishige MA-6N  
Gelseal Amersham
Biosciences Corp.
80-6421-43  
Lactated Ringers Baxter Healthcare 2B8609  
Buprenex Reckit Benckiser
Pharmaceuticals Inc.
NDC No: 12496-
6757-1
Buprenorphine,
injectable
Baytril Bayer NADA 140-913 Enrofloxacin,
antibacterial injectable
2.27% (20ml)
Heating pad – Large Fine Science Tools 21060-10  

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  2. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  3. Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  4. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
  5. Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).
  6. Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).
  7. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  8. Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  9. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  10. Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420, 812-816 (2002).
  11. Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385, 161-165 (1997).
  12. Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
  13. Wang, X. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
  14. Christie, R. H. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer’s disease observed by in vivo multiphoton microscopy. J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).
  15. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).
  16. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
  17. Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer’s disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).
  18. Jung, S. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
  19. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat. Med. 11, 572-577 (2005).
  20. Kim, J. V. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).
  21. Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
  22. Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med. 203, 505-511 (2006).
  23. Lindquist, R. L. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).
  24. Schwickert, T. A. vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure. Nature. 446, 83-87 (2007).

Play Video

Cite This Article
Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (59), e2760, doi:10.3791/2760 (2012).

View Video