Summary

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Published: October 10, 2011
doi:

Summary

Das ganze Berg<em> In situ</em> Hybridisierung Protokoll diskutiert kritische Schritte, die reproduzierbar hohe Qualität der Ergebnisse zur Genexpression Studien in E8.5-E11.5 Tage alten Maus-Embryonen zu gewährleisten.

Abstract

Whole mount in situ Hybridisierung ist eine sehr informative Ansatz für die Definition Genexpressionsmuster in Embryonen. Die in-situ-Hybridisierung Verfahren sind langwierig und technisch anspruchsvolle mit mehreren wichtigen Schritten, die gemeinsam die Qualität des Endergebnisses beitragen. Dieses Protokoll beschreibt im Detail einige wichtige Qualitätskontrolle Schritte zur Optimierung Sondenmarkierung und Leistung. Insgesamt bietet unser Protokoll eine detaillierte Beschreibung der kritischen Schritte notwendig, um reproduzierbar zu erhalten qualitativ hochwertige Ergebnisse. Zunächst beschreiben wir die Erzeugung von Digoxigenin (DIG) markierten RNA-Sonden über In-vitro-Transkription der DNA-Templates mittels PCR generiert. Wir beschreiben drei kritischen Qualitätskontrolle Assays, um die Menge, die Integrität und die spezifische Aktivität des DIG-markierten Sonden zu bestimmen. Diese Schritte sind für die Erzeugung einer Sonde eine ausreichende Empfindlichkeit, um endogene mRNAs in einer ganzen Maus-Embryo erkennen wichtig. Darüber hinaus beschreiben wir für die Fixierung und Lagerung von E8.5-E11.5 Tage alten Maus-Embryonen für die in-situ-Hybridisierung. Dann beschreiben wir detailliert Methoden für begrenzte Proteinase K Verdau der rehydriert Embryonen durch die Details der Hybridisierungsbedingungen, post-Hybridisierung wäscht und RNase-Behandlung, um nicht-spezifische Sonden-Hybridisierung zu entfernen. Ein AP-konjugierte Antikörper verwendet, um die markierten Sonde visualisieren und zeigen die Expressionsmuster der endogenen Transkript. Repräsentative Ergebnisse sind aus der erfolgreichen Experimente und typische suboptimal Experimente gezeigt.

Protocol

1. Riboprobe Generation über In-vitro-Transkription Vorbereitung PCR-Produkte für in-vitro-Transkription Vorlagen. Designing PCR-Primer mit Phagen Transkription Promotor-Sequenzen in ihren 5'-Enden. Hinweis: Die Promotorsequenz hinzugefügt, um der Sense-Strang-PCR-Primer 5'-Ende wird zum Aufzeichnen der Sense-Sonde verwendet werden, und die Promotorsequenz hinzugefügt, um der Antisense-PCR-Primer 5'-Ende wird für die Synthese des anti-sense-S…

Discussion

Die Methoden in diesem Protokoll beschriebenen aus einer Reihe von unterschiedlichen Quellen angepasst und optimiert für die ganze Berg E8.5-E11.5 Tage alten Maus-Embryonen. Methoden für die whole mount in situ Hybridisierung von Wirbeltierembryonen erschien erstmals in den frühen 1990er Jahren 2,5-12. Dieses Protokoll wurde in erster Linie von Methoden für Xenopus Embryonen 7,8 sowie Maus 2,11 entwickelt angepasst. In unserem Protokoll viel Wert auf eine sorgfältige Bewert…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R21MH082360 (BGC) und R01HD056315 (NRM) sowie der University of Georgia unterstützt.

Materials

Name Type Company Catalogue number Comments
Digoxigenin-11-uridine-5′-triphosphate Reagent Roche 11209256910  
Ribonucleoside Triphosphate Set Reagent Roche 11277057001  
Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification Supply Roche 11274015001  
T7 RNA polymerase Reagent Roche 10881767001  
SP6 RNA polymerase Reagent Roche 10810274001  
T3 RNA polymerase Reagent Roche 11031163001  
CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi Reagent Perkin Elmer BLU008X250UC  
DNase I recombinant, RNase-free Reagent Roche 4716728001  
Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder Reagent Fisher BP169-500  
Gel loading buffer Reagent Ambion AM8547  
Hybond-N+, Amersham Supply GE Healthcare RPN82B  
UV Stratalinker 2400 Equipment Stratagene    
Diethyl pyrocarbonate Reagent Sigma D5758-100ML  
Heparin sodium Reagent Acros 41121-0010  
hydrogen peroxide 30% in water Reagent Fisher scientific BP2633-500  
Gluteraldehyde, 8% EM grade Reagent Polysciences 0/710 Use with caution according to manufacture’s instructions
Blocking reagent Reagent Roche 11096176001 Make into 5% stock and store at -20° C
Proteinase K Reagent Roche 3115852001  
Rnase A Reagent Roche 10109142001 Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C.
Rnase T1 Reagent Roche 10109193001  
Ultrapure Formamide Reagent Invitrogen 15515-026  
Levamisole hydrochloride Reagent ICN Biomedicals. Inc 155228  
Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI Reagent Sigma R6625 phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C
Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments Reagent Roche 11093274910  
BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. Reagent Roche 11 442 074 001  
4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit Supply National scientific B7800-2  
Shake N Bake hybridization oven Equipment Boekel Scientific 136400  
Biopsy Sure-Tek Supply Fisherbrand 15-200-402C  
Paraplast Plus tissue embedding medium Reagent Fisherbrand 23-021-400  
Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds Supply Polysciences 18646A  
Colorfrost Plus Microscope slides Supply Fisherbrand 12-550-17  
Nuclear Fast Red Reagent Sigma N8002  
Cytoseal 60 Reagent Richard-Allan Scientific 8310-16  

References

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Cite This Article
Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (56), e2797, doi:10.3791/2797 (2011).

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