Вся эта гора<em> На месте</em> Гибридизации протокола обсуждаются важнейшие шаги, которые обеспечивают воспроизводимое высокое качество результатов для исследования экспрессии генов в E8.5-E11.5 дневных эмбрионов мыши.
Всего крепления в гибридизация является очень информативным подходом для определения моделей экспрессии генов в эмбрионах. На месте процедуры гибридизации длительным и технически сложных с несколькими важными шагами, которые в совокупности способствуют повышению качества конечного результата. Этот протокол подробно описывает несколько ключевых контроля качества шаги для оптимизации маркировки зонда и производительности. Целом, наш протокол содержит подробное описание критических шагов, необходимых для воспроизводимо получать высококачественные результаты. Во-первых, мы описываем поколения digoxygenin (DIG) меченых зондов РНК в пробирке с помощью транскрипции ДНК шаблонов генерируется с помощью ПЦР. Мы описываем три критические анализы контроля качества, чтобы определить количество, целостность и удельной активности DIG-меченых зондов. Эти шаги являются важными для создания зонда достаточной чувствительностью для обнаружения эндогенных мРНК в целом эмбриона мыши.Кроме того, мы опишем методы фиксации и хранения E8.5-E11.5 дневных эмбрионов мыши в гибридизация. Затем мы описываем подробные описания методов для ограниченного протеиназы К переваривания регидратации эмбрионов следуют подробности условий гибридизации, пост-гибридизации моет и РНКазы обработку для удаления неспецифических зонда гибридизации. AP-конъюгированных антител используется для визуализации меченых зондов и выявить паттерн экспрессии эндогенного стенограммы. Представитель результаты показаны от успешных экспериментов и типичные оптимальным экспериментов.
Методы, описанные в этом протоколе были адаптированы из ряда различных источников и оптимизированы для целого крепления E8.5-E11.5 дневных эмбрионов мыши. Методы целом крепления на месте гибридизации эмбрионов позвоночных впервые появился в начале 1990-х 2,5-12. Этот протокол был ад…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами NIH R21MH082360 (BGC) и R01HD056315 (NRM), а также в Университете Джорджии.
Name | Type | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|---|
Digoxigenin-11-uridine-5′-triphosphate | Reagent | Roche | 11209256910 | |
Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche | 11277057001 | |
Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche | 11274015001 | |
T7 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10881767001 | |
SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10810274001 | |
T3 RNA polymerase | Reagent | Roche | 11031163001 | |
CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | Perkin Elmer | BLU008X250UC | |
DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche | 4716728001 | |
Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher | BP169-500 | |
Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene | ||
Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma | D5758-100ML | |
Heparin sodium | Reagent | Acros | 41121-0010 | |
hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher scientific | BP2633-500 | |
Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
Blocking reagent | Reagent | Roche | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
Proteinase K | Reagent | Roche | 3115852001 | |
Rnase A | Reagent | Roche | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
Rnase T1 | Reagent | Roche | 10109193001 | |
Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals. Inc | 155228 | |
Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche | 11093274910 | |
BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche | 11 442 074 001 | |
4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National scientific | B7800-2 | |
Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisherbrand | 15-200-402C | |
Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisherbrand | 23-021-400 | |
Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences | 18646A | |
Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisherbrand | 12-550-17 | |
Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma | N8002 | |
Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |