Summary
हम axonal चोट के बाद पृष्ठीय रूट ganglia ऊतक से chromatin immunoprecipitation के लिए एक विधि उपस्थित थे. दृष्टिकोण के विशिष्ट प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों और दोनों परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में घायल axons के उत्थान के लिए histone और महत्वपूर्ण डीएनए की epigenetic संशोधन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) में axons जबकि परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) में उन चोट के बाद एक सीमित हद तक (टेंग एट अल., 2006) को पुनर्जीवित करते नहीं पुनर्जीवित करते हैं . यह मान्यता है कि transcriptional neurite और axonal परिणाम के लिए आवश्यक कार्यक्रमों पीएन (Makwana एट अल., 2005) में चोट पर फिर सक्रिय कर रहे हैं. हालांकि vivo में neuronal जीन विनियमन का विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध उपकरणों सीमित है और अक्सर चुनौतीपूर्ण हैं.
पृष्ठीय रूट ganglia (DRG) एक उत्कृष्ट चोट मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं क्योंकि दोनों सीएनएस और पीएन एक बंटवारा ही सोम से उद्भव अक्षतंतु द्वारा innervated हैं. ganglia सेल शरीर में जहां सभी transcriptional घटनाओं होते की एक असतत संग्रह का प्रतिनिधित्व करते हैं, और इस तरह transcriptional गतिविधि का एक स्पष्ट रूप से परिभाषित क्षेत्र है कि आसानी से और reproducibly जानवर से हटाया जा सकता है प्रदान करते हैं. पीएन (जैसे sciatic तंत्रिका), जहां axonal उत्थान होती है में तंत्रिका तंतुओं की चोट transcriptional कार्यक्रमों का एक सेट है कि CNS में एक इसी तरह की चोट के जवाब उन जहां उत्थान जगह (जैसे रीढ़ की हड्डी नहीं ले करता है से अलग कर रहे हैं प्रकट करना चाहिए ). प्रतिलेखन कारक बंधनकारी, histone और डीएनए की चोट से या तो पीएन या सीएनएस के परिणामस्वरूप संशोधन के लिए साइटें chromatin immunoprecipitation (चिप) का उपयोग लक्षण वर्णन किया जा सकता है.
यहाँ, हम एक चिप axonal चोट के बाद तय माउस DRG ऊतक का उपयोग प्रोटोकॉल का वर्णन. इस शक्तिशाली संयोजन समर्थक उत्थान chromatin axonal उत्थान को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक वातावरण निस्र्पक के लिए एक साधन प्रदान करता है.
Protocol
1. Sciatic और पृष्ठीय स्तंभ तंत्रिका चोट
- पशु शल्य तौलिया पर रखा गया है और इसे नीचे एक thermopad प्रक्रिया भर में मौजूद है 37 पर माउस के शरीर का तापमान रखने डिग्री सेल्सियस सभी जानवरों की एक सतत / isoflurane हे 2 प्रशासन के साथ शल्य चिकित्सा के लिए anesthetized हैं. सर्जिकल उपकरणों की प्रक्रिया से पहले autoclaved हैं.
- Sciatic चोट के लिए, दोनों hindquarters ध्यान मुंडा रहे हैं और depilation Betadyne 3 बार द्वारा पीछा शराब के साथ त्वचा की सफाई करने से पहले सामान्य बाल पदच्युत के साथ पूरा हो गया है.
- sciatic तंत्रिका एक 4 मिमी चीरा पीछे और त्वचा के माध्यम से मध्य जांघ पर जांध की हड्डी के समानांतर बनाने के द्वारा और मांसपेशियों को ठीक संदंश के साथ मछलियां ग्रीवा के अलावा फैल द्वारा अवगत कराया है.
- तब उजागर sciatic तंत्रिका घायल है, और त्वचा दो सीवन क्लिप के साथ बंद कर दिया है.
नोट: एक ही चीरा sciatic तंत्रिका का पर्दाफाश किया है, लेकिन घाव sutured है बंद तंत्रिका नकली चोट के लिए बरकरार जा.
- पृष्ठीय स्तंभ चोट के लिए, माउस के पीछे ध्यान मुंडा है और depilation शराब स्प्रे / ज़ोर से मारना के साथ त्वचा की सफाई करने से पहले सामान्य बाल पदच्युत के साथ पूरा हो गया है.
- रीढ़ की हड्डी से T7 के बारे में T13 के लिए एक 2.5 सेमी चीरा द्वारा अवगत कराया है. त्वचा के अलावा फैला हुआ है, और संयोजी ऊतक T9 से T11 कशेरुका के साथ हटा दिया जाता है.
- एक laminectomy T10 स्तर पर किया जाता है
नोट: अधिकांश प्रयोगों के लिए, laminectomy शाम चोट माना जाता है.
- ऊतकों को Xylocain की कुछ बूँदें जोड़ रहे हैं के लिए कॉर्ड चतनाशून्य करना, और dura मेटर हटा दिया जाता है ध्यान दे करने के लिए रीढ़ की हड्डी छू नहीं.
- पृष्ठीय स्तंभों और घायल मांसपेशियों करीब sutured है, फिर से ध्यान दे करने के लिए रीढ़ की हड्डी छू नहीं कर रहे हैं. अंत में, त्वचा sutured है सीवन क्लिप के साथ बंद. Buprenorphine (0.1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) दो बार दैनिक प्रशासित किया जाना चाहिए 48 घंटे के लिए या जब तक की जरूरत नहीं रह.
2. क्रॉस को जोड़ने
- Euthanization के बाद घायल चूहों से L4 और L5 DRG काटना. बर्फ ठंड + HBSS protease inhibitors के कॉकटेल (2 घायल और 2 नकली DRG 4 पशुओं के एक कुल के लिए प्रत्येक जानवर से) में 16 DRG की कुल लीजिए.
- संक्षेप में अपकेंद्रित्र DRG, तो ध्यान से HBSS हटाने और जोड़ने पीबीएस + protease inhibitors के कॉकटेल में 1% formaldehyde के 500 μl और 37 पर 30 मिनट के लिए नमूना सेते डिग्री सेल्सियस
महत्वपूर्ण कदम ताजा, आणविक जीव विज्ञान ग्रेड formaldehyde का प्रयोग करें.
- निर्धारण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते बंद glycine के 125 मिमी जोड़ें.
- संक्षेप में अपकेंद्रित्र, बंद बफर aspirate, और ऊतक 500 μl ठंडा पीबीएस + protease inhibitors के कॉकटेल के साथ दो बार धोने.
3. नाभिक तैयारी और chromatin कर्तन
- बंद पीबीएस Aspirate, एसडीएस lysis बफर के 400 μl जोड़ने के लिए, एक पूर्व ठंडा microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण, और micropestle के साथ लगभग 30 स्ट्रोक के साथ ऊतकों को बाधित.
महत्वपूर्ण कदम है. Lysis और ऊतकों के विघटन Crosslinked chromatin की एक अच्छी उपज के लिए महत्वपूर्ण हैं.
- 8 दालों, 10 70% उत्पादन (Bandelin, Sonoplus GM70) पर एक दूसरे के साथ नमूना Sonicate.
चेतावनी. Chromatin के बाल काटना अपने विशेष sonication के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए सेट अप और chromatin की उचित विखंडन वास्तविक आईपी प्रयोग चल रहा है से पहले जाँच की जानी चाहिए (3 अनुभाग देखें ).
नोट chromatin के विखंडन. Micrococcal nuclease पाचन (MNase) द्वारा निष्पादित किया जा सकता है. अंगूठे का एक नियम के रूप में विखंडन sonication द्वारा तय ऊतक के लिए पसंद है, जबकि MNase पाचन देशी ऊतक chromatin immunoprecipitation के लिए इष्ट है. क्रॉस से जुड़े, sheared chromatin 2 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है, लेकिन दोहराया / फ्रीज पिघलना चक्र से बचने के.
4. Chromatin पाचन के विश्लेषण (अनुशंसित)
- अपने sheared विश्लेषण के लिए नमूना chromatin के 10 μl निकालें. नमूना NaCl के 200 मिमी जोड़ें और 65 पर 2 के लिए डिग्री सेल्सियस incubating द्वारा पार से लिंक रिवर्स.
- डीएनए (8 अनुभाग देखें) शुद्ध और एक 1% agarose जेल चला. डीएनए लगभग 200-1000 बीपी (चित्रा 1) की लंबाई के लिए खंडित किया जाना चाहिए.
चेतावनी. Chromatin अधिक विखंडन कमी आई संकेत करने के लिए नेतृत्व सकता है, जबकि अधूरा विखंडन कम संकल्प और वृद्धि की पृष्ठभूमि के लिए नेतृत्व करेंगे.
5. Immunoprecipitation
- Immunoprecipitation प्रतिक्रियाओं की संख्या (नीचे नोट देखें) निर्धारित करते हैं, और नए ट्यूबों में समान रूप से नमूने विभाजित. प्रत्येक की मात्रा लाओचिप + बफर protease inhibitors के कॉकटेल के साथ 500 μl.
- अपने पतला नमूने के 5 μl निकालें और एक नया ट्यूब में स्थानांतरित. यह 1% इनपुट नमूना है और यह -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाएगा जब तक जरूरत है (धारा 7).
- प्रत्येक immunoprecipitation के लिए, उपयुक्त एंटीबॉडी या सामान्य आईजीजी नियंत्रण जोड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस रोटेशन के साथ रात भर पर सेते हैं.
नोट जब immunoprecipitation की संख्या, एक सकारात्मक नियंत्रण (जैसे histone H3 एंटीबॉडी) और एक नकारात्मक नियंत्रण (सामान्य आईजीजी) निर्धारित माना जाना चाहिए. एंटीबॉडी की मात्रा प्रत्येक IP के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के बीच बदलता है और empirically निर्धारित किया जाना चाहिए. हालांकि, यह आमतौर पर 2-10 की एक सीमा के भीतर है / छ immunoprecipitation?.
- अपने परिसर में / एंटीबॉडी / प्रोटीन और डीएनए immunoprecipitate, चिप ग्रेड प्रोटीन जी चुंबकीय मोती के 30 μl जोड़ने और 4 में 2 घंटे के लिए सेते ° रोटेशन के साथ सी.
6. वॉशिंग
- पुल डाउन बाध्य chromatin - मनका जटिल करने के लिए, चुंबकीय रैक पर जगह ट्यूब. रुको जब तक समाधान स्पष्ट है और फिर ध्यान से अपनी सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- मोतियों के लिए कम नमक धोने के 1 मिलीग्राम (चिप बफर) जोड़ें और 4 बजे सेते ° रोटेशन के साथ 3-5 मिनट के लिए सी, तब मोती नीचे खींचने के लिए और बंद के रूप में 6.1 में कदम धोने aspirate. 3 washes के एक कुल के लिए इस चरण को दोहराएँ.
- मोती उच्च नमक धोने बफर के 1 मिलीलीटर (चिप बफर + 350 मिमी NaCl) जोड़ें और रोटेशन के साथ 3-5 मिनट के लिए सेते हैं, तो मोती नीचे खींचने के लिए और बंद के रूप में 6.1 में कदम धोने aspirate.
7. Elution और पार से जोड़ने के उत्क्रमण
- आपके इनपुट के नमूने ले लो -20 की डिग्री सेल्सियस, 150 चिप Elution बफर के μl जोड़ने और 7.5 कदम जब तक कमरे के तापमान पर अलग सेट.
- 6.3 चरण से प्रत्येक IP नमूना के लिए 1x चिप Elution बफर के 150 μl जोड़ें.
- Thermomixer में ट्यूबों प्लेस और मोतियों से ° कोमल vortexing के साथ 30 मिनट के लिए सी 65 में नमूने incubating द्वारा chromatin elute.
- रैक पर चुंबकीय मोती नीचे खींचो, और ध्यान से नए ट्यूबों में eluted chromatin (सतह पर तैरनेवाला) हस्तांतरण.
- आपके इनपुट के नमूने सहित सभी ट्यूबों, 2 घंटे के लिए NaCl और 40 / 65 पर μg proteinase कश्मीर और सेते की प्रतिक्रिया ° सी 200mm जोड़ने.
ध्यान दें. कमरे के तापमान पर elution कदम प्रदर्शन किया जा सकता है है, भी, लेकिन यह कुशल के रूप में नहीं हो सकता है .
8. डीएनए वसूली
- 7.5 30 सेकंड के लिए और कदम भंवर से अपने नमूने के 1 / Phenol क्लोरोफॉर्म की मात्रा में जोड़ें.
- 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक microcentrifuge में अधिकतम गति से अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से जलीय चरण (ऊपरी) नई ट्यूबों में, जलीय चरण 1 क्लोरोफॉर्म की मात्रा जोड़ने, और 30 सेकंड के लिए भंवर ठीक.
- 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक microcentrifuge में अधिकतम गति से अपकेंद्रित्र.
- ध्यान नए ट्यूबों में जलीय चरण (ऊपरी) ठीक है, तो NaOAc के 300mm जोड़ने के लिए, बहुत ठंडा 100% इथेनॉल के 20 μg / ग्लाइकोजन की प्रतिक्रिया है, और 2.5 वॉल्यूम.
चेतावनी ग्लाइकोजन के रूप में एक वाहक है, के अलावा, के लिए अपेक्षाकृत छोटे आकार के डीएनए टुकड़े के वर्षण बढ़ाने की जरूरत है.
- -80 पर डिग्री सेल्सियस 2 घंटे के लिए वेग डीएनए को सेते हैं.
नोट. वर्षण कदम भी -20 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्रदर्शन किया जा सकता है
- 4 में 20 मिनट के लिए एक microcentrifuge में अधिकतम गति पर नमूने अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- ध्यान से सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और ठंडा 70% इथेनॉल के 300 μl के साथ उपजी डीएनए छर्रों धोने.
- 4 में 10 मिनट के लिए एक microcentrifuge में अधिकतम गति पर नमूने अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- सावधानी के रूप में सतह पर तैरनेवाला जितना संभव हटाने और छर्रों हवा - सूखी.
- बाँझ एच 2 ओ के 20 μl में Resuspend नमूने अब पीसीआर के लिए तैयार हैं, या डीएनए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है
9. प्रतिनिधि परिणाम
Sciatic घाव निम्नलिखित DRGs में एक चिप प्रयोग के एक प्रतिनिधि परिणाम (आंकड़े 1 और 2) दिखाया गया है. सबसे पहले, हम लगभग 200-1000 बीपी (चित्रा 1) की लंबाई के लिए खंडित डीएनए दिखा. दूसरा, हम प्रोटीन (जीएपी 43) केवल 43 पर sciatic तंत्रिका चोट (4 लेन, चित्रा 2, 5) जुड़े विकास के प्रॉक्सिमल प्रमोटर से एक पीसीआर संकेत निम्नलिखित चिप प्रदर्शित करता है. कोई पीसीआर संकेत मौजूद है, जब जानवर एक दिखावा चोट केवल प्राप्त (3 लेन), और जब आईपी (लेन 5 और 6) के लिए सामान्य आईजीजी सीरम का उपयोग कर. एंटीबॉडी की विशिष्टता के लिए परीक्षण करने के लिए, हम एक ही डीएनए नमूने का विश्लेषण किया, लेकिन नियंत्रण प्राइमर सेट है जो ब्याज जहां कोई अधिभोग उम्मीद है की हमारी जीन की 3'-UTR में एक क्षेत्र का पता लगाता है. पीसीआर संकेतों सभी (3-6 गलियों, चित्रा 2, 3) इनपुट संकेत के लिए छोड़कर, गलियों, गैर आईपी मानक पीसीआर नियंत्रण के रूप में डीएनए के नमूने का प्रतिनिधित्व (1-2 लेन, figu से अनुपस्थित हैं2 पुनः). इस चिप प्रक्रिया या तो sciatic या रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय स्तंभ चोट के बाद के रूप में एक योजनाबद्ध (चित्रा 3) में संक्षेप किया जा सकता है.
चित्रा 1. उलट डीएनए पार से जुड़े है कि टुकड़ा लंबाई की उचित श्रृंखला के लिए किया गया है sonication द्वारा sheared agarose जेल .
चित्रा 2 DRG ऊतक से अर्द्ध मात्रात्मक पीसीआर sciatic तंत्रिका घाव दिखा कि acetylated p53 गैप - sciatic तंत्रिका चोट के बाद 48 घंटे 43 प्रॉक्सिमल प्रमोटर क्षेत्र को बांधता निम्नलिखित परिणाम है. नियंत्रण पीसीआर ही DRG ऊतक शो है कि acetylated p53 गैप-43 जीन (एस = शाम, मैं घायल =) के 3'-untranslated क्षेत्र (UTR) में स्थित डीएनए के नियंत्रण क्षेत्र करने के लिए बाध्य नहीं करता है.
चित्रा 3 एक सामान्य sciatic तंत्रिका पर घाव साइटों के स्थान, और पृष्ठीय स्तंभ दिखा आरेख.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल के लिए सीधे axonal चोट के बाद वयस्क तंत्रिका तंत्र में axonal उत्थान के दौरान chromatin वातावरण के बारे में पूछने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. यह chromatin immunoprecipitation साथ DRG चोट मॉडल शामिल transcriptional और epigenetic चोट के बाद पीएन या CNS या तो वातावरण की जांच करने के लिए. यह जांचकर्ताओं जो अपने पसंदीदा प्रतिलेखन कारक के लिए ख्यात बाध्यकारी साइटों विशेषताएँ चाहते हैं, और यह निर्धारित करने के लिए कि क्या इन साइटों के अधिभोग चोट के जवाब में होता है के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. Histones और इन साइटों पर डीएनए के epigenetic संशोधन भी एक साथ नजर रखी जा सकता है. एक समान प्रोटोकॉल चेहरे तंत्रिका घाव, जहां चेहरे तंत्रिका नाभिक brainstem से dissected किया जा सकता है और चिप के द्वारा संसाधित के बाद किया जा सकता है के रूप में हम पहले की रिपोर्ट (Tedeschi एट अल., 2009).
Chromatin immunoprecipitation assays के लिए विशिष्ट, प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम हैं, (1) कुशल विखंडन और डीएनए प्रोटीन परिसर के solubilization, और (2) अपने हित के प्रोटीन के लिए एक अच्छा immunoprecipitation एंटीबॉडी की उपलब्धता. एक सीमा है कि इन दो चरणों उलझाना सकता है सामग्री शुरू करने के निम्न स्तर है. मस्तिष्क या स्पाइनल कॉर्ड जैसे अन्य संरचनाओं, ऊतक के एक अपेक्षाकृत छोटी राशि प्रदान DRG की तुलना में. इसके अलावा, DRG रूप में अच्छी तरह के रूप में न्यूरॉन्स glial कोशिकाओं है, जो सभी के अलग chromatin वातावरण हो सकता है की एक मिश्रण आबादी के होते हैं. यह विषम आईपी संकेतों को नेतृत्व कर सकते हैं, लेकिन इस चेतावनी सबसे तंत्रिका तंत्र से ली गई नमूनों में मौजूद है. एक संभावित हल transgenically fluorescently लेबल DRG न्यूरॉन्स की छँटाई फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल, (YFP - एच चूहों, Bogdan एट अल, 2004 उदाहरण के लिए देखें), या इम्युनो - चुंबकीय (मोती ली एट अल के माध्यम से न्यूरॉन्स के अलगाव के बाद चिप प्रदर्शन है . ,) 2005. हालांकि, इन दो दृष्टिकोणों के लिए DRGs में चिप के लिए मान्य करने की आवश्यकता है और संभावना है सामग्री शुरू की एक वृद्धि की राशि की आवश्यकता होगी.
हम सफलतापूर्वक इस पद्धति का इस्तेमाल किया है कई प्रतिलेखन कारकों और coactivators के लिए जाना जाता उत्थान जुड़े जीन के प्रमोटर पर बाध्यकारी साइटों की पहचान करने के लिए, और हम दोनों अर्द्ध मात्रात्मक और मात्रात्मक पीसीआर तरीकों का इस्तेमाल किया है immunoprecipitated डीएनए का पता लगाने. इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अलावा टाइलों प्रोटीन की चिप (चिप चिप) के बाद उपयोग हो सकता है, के रूप में अंतिम डीएनए संकेत का पता लगाने का मतलब सकता है. चिप चिप पर काफी एक उच्च throughput निष्पक्ष दृष्टिकोण के माध्यम से की पहचान प्रतिलेखन साइटों की संख्या में वृद्धि होगी. यह भी कैसे दो या दो से अधिक प्रतिलेखन कारक cooperatively एक जीनोमिक स्तर पर बातचीत हो सकती है के अध्ययन के लिए अनुमति दे सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम Andrea Tedeschi ठीक धुन चिप के लिए शर्तों के लिए अपने योगदान के लिए प्रयोगशाला और Ricco Lindner में प्रारंभिक चिप प्रयोगों की स्थापना में मदद के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. इस काम Hertie फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था, फॉर्च्यून अनुदान, विश्वविद्यालय Tuebingen, और DFG डि 1497/1-1 अनुदान (सभी सिमोन डि Giovanni के लिए दी गई).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip Rack (8 well) | EMD Millipore | 20-400 | |
| Chloroform | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS Lysis Buffer | Upstate, Millipore | 20-163 |
References
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- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).
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