Summary
Vi presenterar en metod för kromatin immunoprecipitation från dorsalrotsganglier vävnad efter axonal skada. Den metod som kan användas för att identifiera specifika transkriptionsfaktor bindningsställen och epigenetiska modifiering av histon och DNA viktiga för regenerering av skadade axoner i både perifera och centrala nervsystemet.
Abstract
Axoner i det centrala nervsystemet (CNS) inte regenerera inte medan de i det perifera nervsystemet (PNS) inte regenerera i begränsad omfattning efter skada (Teng et al., 2006). Det är känt att transkriptionell program som krävs för neurite och axonutväxt är återaktiveras vid skada i PNS (Makwana et al., 2005). Men de verktyg som finns för att analysera neuronala genreglering in vivo är begränsade och ofta utmanande.
Dorsalrotsganglier (DRG) erbjuder ett utmärkt system skada modellen eftersom både CNS och PNS är innerveras av en tvåspetsnitar Axon har sitt ursprung från samma soma. Den ganglier representerar en diskret samling celler organ där alla transkriptionell händelser inträffar, och därmed ge en tydligt definierad region i transkriptionell aktivitet som kan enkelt och reproducerbart avlägsnas från djuret. Skada av nervtrådar i PNS (t.ex. ischiasnerven), där axonal regeneration sker skall avslöja en uppsättning transkriptionell program som skiljer sig från dem som svarar på en liknande skada i CNS, då regenerering inte sker (t.ex. ryggmärg ). Platser för transkriptionsfaktor bindande histon och DNA-modifiering som härrör från skada på antingen PNS eller CNS kan karakteriseras med hjälp av kromatin immunoprecipitation (chip).
Här beskriver vi ett ChIP protokoll med fixerat musen DRG efter axonal skada. Denna kraftfulla kombination ger ett medel för att karakterisera den pro-regeneration kromatin miljö som krävs för att främja axonal regeneration.
Protocol
1. Ischias och rygg kolumnen nervskada
- Djuret är placerad på en kirurgisk handduk och under den en thermopad är närvarande under hela förfarandet att hålla kroppstemperaturen på musen vid 37 ° C. Alla djur bedövas för kirurgi med ett kontinuerligt isofluran / O 2 förvaltningen. Kirurgiska instrument autoklaveras innan förfarandet.
- För ischiasnerven skada, är båda bakbenen omsorgsfullt rakad, och epilering avslutas med generisk hårborttagare före rengöring huden med alkohol följt av Betadyne 3 gånger.
- Ischiasnerven är utsatt genom att göra en 4 mm snitt posteriort och parallellt med lårbenet på mitten av låret genom huden och genom att sprida musklerna isär av biceps femoris med fin pincett.
- De exponerade ischiasnerven är då skadade och huden är stängd med två suturklämmor.
OBS: Samma snitt görs för att exponera ischiasnerven, men såret sys stängd lämnar nerven intakt för bluff skada.
- För dorsala kolumnen skada, är baksidan av musen noggrant rakade, och epilering avslutas med generisk hårborttagare före rengöring av huden med alkohol spray / dra.
- Ryggmärgen är exponerad genom ett 2,5 cm snitt från ca T7 till T13. Huden är särade och bindväv avlägsnas längs kotan från T9 till T11.
- En laminektomi utförs vid T10 nivå
OBS: För de flesta experiment är laminektomi anses vara den Sham skada.
- Några droppar Xylocain läggs till vävnad för att söva ner sladden, och dura mater tas bort, att uppmärksamma att inte röra ryggmärgen.
- Den dorsala kolumnerna är skadade och muskeln sys nära, återigen uppmärksamma att inte röra ryggmärgen. Slutligen är huden sys stängd med suturklämmor. Buprenorfin (0,1 mg / kg kroppsvikt) skall ges två gånger dagligen under 48 timmar eller tills det inte längre behövs.
2. Tvärbindning
- Dissekera L4 och L5 DRG från skadade möss efter euthanization. Samla totalt 16 DRG i iskallt HBSS + proteashämmare cocktail (2 skadade och 2 bluff DRG från varje djur för totalt 4 djur).
- Kortfattat centrifug DRG, sedan försiktigt bort HBSS och tillsätt 500 l på 1% formaldehyd i PBS + proteashämmare cocktail och inkubera provet i 30 minuter vid 37 ° C.
Avgörande steg. Använd färsk, molekylär formaldehyd biologi klass.
- Lägg till 125 mm av glycin för att stoppa fixering och inkubera 5 minuter vid rumstemperatur.
- Kortfattat centrifugering, aspirera av buffert, och tvätta vävnaden två gånger med 500 l iskallt PBS + proteashämmare cocktail.
3. Nuclei förberedelser och kromatin klippning
- Aspirera av PBS, tillsätt 400 ìl av SDS lyseringsbuffert, överföring till en pre-kyld mikrocentrifugrör, och störa vävnaden med cirka 30 slag med micropestle.
Avgörande steg. Lysis och störningar av vävnaden är avgörande för en god avkastning på tvärbunden kromatin.
- Sonikera provet med 8 pulser, 10 sekunder vardera 70% utgång (Bandelin, Sonoplus GM70).
VARNING. Klippning av kromatinet måste optimeras för just din sonication upprätta och korrekt uppdelning av kromatin bör kontrolleras innan du kör den aktuella IP-experimentet (se avsnitt 3).
OBS. Fragmenteringen av kromatinet kan också utföras av micrococcal nukleas (MNase) matsmältningen. Som en tumregel, är fragmenteringen av ultraljudsbehandling föredras för fast vävnad, medan MNase rötning är att föredra för infödda vävnad kromatin immunoprecipitation. Tvärbunden kan klippt kromatin förvaras vid -80 ° C i upp till 2 månader, men undvik upprepad frysning / upptining.
4. Analys av kromatin matsmältningen (rekommenderas)
- Ta bort 10 l av din klippt kromatin prov för analys. Lägg till 200 mm av NaCl till provet och vända den gränsöverskridande länken genom att inkubera vid 65 ° C i 2h.
- Rena DNA (se avsnitt 8) och kör en 1% agarosgel. DNA ska vara fragmenterade till en längd av ca 200-1000 bp (Figur 1).
VARNING. Alltför fragmentering av kromatin kan leda till minskad signal, om än ofullständiga fragmentering leder till minskad upplösning och ökad bakgrund.
5. Immunoprecipitation
- Bestäm antalet immunoprecipitation reaktioner (se nedan), och dela prover lika i nya rör. Ta volymen av varjeupp till 500 l med Chip buffert + proteashämmare cocktail.
- Ta bort 5 ìl av dina utspädda provet och överför till ett nytt rör. Detta är din 1%-ingång prov och det kommer att lagras vid -20 ° C tills det behövs (avsnitt 7).
- För varje immunoprecipitation, tillsätt lämplig antikropp eller normala IgG-kontroll och inkubera vid 4 ° C över natten med rotation.
OBS. Vid bestämning av antalet immunoprecipitation, en positiv kontroll (t.ex. Histon H3 antikropp) och en negativ kontroll (Normal IgG) bör övervägas. Mängden antikroppar som används för varje IP varierar mellan antikroppar och måste vara empiriskt bestämmas. Men det är oftast inom ett intervall på 2-10? G / immunoprecipitation.
- För att immunoprecipitate din antikropp / protein / DNA komplex, tillsätt 30 l av chip grad Protein G magnetiska kulor och inkubera i 2 timmar vid 4 ° C med rotation.
6. Tvätt
- Att pull-down bundna kromatin-pärla komplex, placera röret på den magnetiska racket. Vänta tills lösningen är klar och sedan försiktigt bort dina supernatant.
- Tillsätt 1 ml låg salthalt tvätta (chip buffert) till pärlor och inkubera vid 4 ° C i 3-5 minuter med rotation, dra sedan ner pärlor och aspirera bort tvätta i steg 6,1. Upprepa detta steg för totalt 3 tvättar.
- Tillsätt 1 ml av hög salt tvättbuffert (chip buffert + 350 mM NaCl) till pärlor och inkubera i 3-5 minuter med rotation, dra sedan ner pärlor och aspirera bort tvätta i steg 6,1.
7. Eluering och återföring av tvärbindning
- Ta din inmatning prover från -20 ° C, tillsätt 150 l av chip Elution buffert och ställ åt sidan vid rumstemperatur tills steg 7,5.
- Tillsätt 150 l 1X ChIP Elution buffert för varje IP-prov från steg 6,3.
- Placera rören i en thermomixer och eluera kromatinet från pärlor genom att inkubera prov vid 65 ° C i 30 minuter med varsam vortexa.
- Pull-down pärlor på den magnetiska rack, och noggrant överföra elueras kromatin (supernatant) i nya rör.
- Till alla rör, inklusive din input prover, lägga 200mm av NaCl och 40 mikrogram / reaktion proteinas K och inkubera vid 65 ° C i 2 timmar.
OBS. Eluering steg kan utföras i rumstemperatur också, men det kan vara inte så effektiva.
8. DNA återhämtning
- Tillsätt 1 volym av fenol / kloroform för att dina prover från steg 7,5 och skaka i 30 sekunder.
- Centrifugera vid maximal hastighet i mikrocentrifug vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Försiktigt återhämta vattenfasen (övre) fasen till nya rör, tillsätt 1 volym kloroform till vattenfasen, och vortexa i 30 sekunder.
- Centrifugera vid maximal hastighet i mikrocentrifug vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Försiktigt återhämta vattenfasen (övre) fasen till nya rör, lägg sedan till 300 mm i NaOAc, 20 mikrogram / reaktion av glykogen, och 2,5 volymer av iskall 100% etanol.
VARNING. Tillägget av en transportör, som glykogen, behövs för att öka nederbörden relativt liten storlek DNA-fragment.
- Inkubera vid -80 ° C i 2 timmar för att fälla DNA.
OBS. Nederbörden steg kan också göras över natten vid -20 ° C.
- Centrifugera proverna vid maximal hastighet i en mikrocentrifug under 20 minuter vid 4 ° C.
- Ta försiktigt bort supernatanten och tvätta fälls DNA-pellets med 300 ìl iskall 70% etanol.
- Centrifugera proverna vid maximal hastighet i en mikrocentrifug i 10 minuter vid 4 ° C.
- Ta försiktigt bort så mycket supernatanten som möjligt och låt pellets lufttorka.
- Resuspendera i 20 l steril H 2 O. Prover är nu redo för PCR, eller DNA kan förvaras vid -20 ° C.
9. Representativa resultat
Ett representativt resultat av ett chip experiment i DRG efter ischiasnerven lesion visas (figur 1 och 2). Först visar vi fragmenterat DNA till en längd av ca 200-1000 bp (Figur 1). För det andra visar vi en PCR-signal efter chip från den proximala främjare av tillväxt tillhörande protein-43 (GAP-43) bara på ischiasnerven skada (Lane 4, 2 figur 5). Ingen PCR-signal när djuret får en bluff skada endast (Lane 3), och när du använder normala IgG-serum för IP (Lane 5 och 6). För att testa om det speciella med antikroppen, analyserade vi samma DNA-prover, men använde en uppsättning kontroll primer som upptäcker en region i 3'-UTR av våra gener av intresse där ingen inflyttning förväntas. PCR-signaler är frånvarande från alla banor (banor 3-6, 2 figur, 3 '), med undantag för insignalen, som representerar icke-IP-DNA-prover som standard PCR-kontroller (Lane 1-2, Figure 2). Detta chip proceduren kan utföras efter antingen ischias-eller spinal dorsala kolumnen skada som sammanfattas i en schematisk (Figur 3).
Figur 1. Agarosgel i omvänd tvärbunden DNA som har klippt av ultraljudsbehandling till rätt mängd fragment längder.
Figur 2. Semi-kvantitativa PCR-resultat från DRG vävnad efter ischiasnerven lesion som visar att acetylerade p53 binder till GAP-43 proximala promotorregion 48 timmar efter att skada ischiasnerven. Styr PCR från samma DRG vävnaden visar att acetylerade p53 binder inte till en kontroll region av DNA som ligger i 3'-oöversatta regionen (UTR) av GAP-43-genen (S = Sham, I = skadade).
Figur 3. En allmän diagram som visar platsen för lesionen platser på ischiasnerven och dorsala kolumnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger en metod att direkt fråga om kromatinet miljön under axonal regeneration i den vuxna nervsystemet efter axonal skada. Den innehåller de DRG skada modellen med kromatin immunoprecipitation att utforska transkriptionell och epigenetiska miljö efter skada antingen PNS eller CNS. Det är särskilt användbart för utredarna som vill karaktärisera förmenta bindningsställen för sin favorit transkriptionsfaktor, och för att avgöra om beläggning av dessa platser sker som svar på skada. Epigenetisk modifiering av histoner och DNA på dessa platser kan också samtidigt övervakas. Ett liknande protokoll kan utföras efter ansikts nervskada, där ansiktsnerven kärnor kan skäras ut från hjärnstammen och bearbetas av Chip, som vi tidigare rapporterat (Tedeschi et al., 2009).
Som typiskt för kromatin immunoprecipitation analyser, två kritiska steg i protokollet (1), effektiv fragmentering och lösningsgörande av DNA-protein komplex, och (2) att det finns en bra immunoprecipitation antikropp för ditt protein av intresse. En begränsning som kan förväxla dessa två steg är den låga utgångsmaterial. Jämfört med andra strukturer som hjärnan eller ryggmärgen, DRG ger en relativt liten mängd vävnad. Dessutom består DRG av en blandning population av nervceller och gliaceller, som alla kan ha olika kromatin miljöer. Detta kan leda till heterogena IP-signaler, men detta förbehåll finns i de flesta prover tas från nervsystemet. En möjlig lösning är att utföra ChIP efter fluorescerande aktiverad cell sortering av transgenically fluorescerande DRG nervceller, (se till exempel YFP-H möss, Bogdan et al., 2004), eller immuno-isolering av nervceller via magnetiska kulor (Lee et al. , 2005). Men dessa två tillvägagångssätt måste valideras för CHIP i DRG och kommer sannolikt att behöva en ökad mängd utgångsmaterial.
Vi har framgångsrikt använt denna metod för att identifiera bindningsställen för flera transkriptionsfaktorer och coactivators vid främjare av kända samband förnyelse gener, och vi har använt både semi-kvantitativa och kvantitativa PCR-metoder för att upptäcka immunoprecipitated DNA. Ett framtida tillägg till detta protokoll skulle kunna vara att använda kaklade microarrays efter chip (chip-on-chip), som medel för att upptäcka den slutliga DNA-signalen. Chip-on-chip skulle kraftigt öka antalet identifierade transkription webbplatser via en hög genomströmning objektiva tillvägagångssätt. Det skulle också möjliggöra studier av hur två eller flera transkriptionsfaktor kan samarbeta samverka på en genomisk nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Andrea Tedeschi för hjälp med att den inledande ChIP experiment i laboratorium och Ricco Lindner för hans bidrag till att finjustera villkoren för Chip. Detta arbete stöddes av Hertie stiftelsen, Fortune Grant, universitetet i Tübingen, och DFG DI 1497/1-1 bidrag (alla beviljas Simone Di Giovanni).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip Rack (8 well) | EMD Millipore | 20-400 | |
| Chloroform | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS Lysis Buffer | Upstate, Millipore | 20-163 |
References
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
