Lentivirus-medierad genetisk manipulation och visualisering av Olfactory sensoriska neuroner In vivo</em

Summary

Vi presenterar en Lentiviral teknik för genetisk manipulation och visualisering av enstaka luktsinnet sensoriska neuron axon och sin terminal arborization<em> In vivo</em>.

Abstract

Utveckling av en exakt lukt krets bygger på exakt prognos över luktsinnet sensoriska neuron (OSN) axoner till sina synaptiska mål i luktbulben (OB). De molekylära mekanismerna för OSN axon tillväxt och riktar förstås inte heller bra. Manipulera genuttryck och efterföljande visualisering av enstaka OSN axoner och deras terminal berså morfologi har hittills varit utmanande. För att studera geners funktion på cell nivå inom en angiven tidsram, utvecklade vi en Lentiviral baserad teknik för att manipulera genuttryck i OSN in vivo. Lentiviral Particles levereras till OSN genom mikroinjektion i luktepitel (OE). Expression kassetter sedan permanent integreras i genomet av transduced OSN. Grönt fluorescerande protein uttryck identifierar infekterade OSN och beskriver hela sin morfologi, inklusive axonet terminalen bersån. På grund av den korta handläggningstid mellan mikroinjektion och reporter upptäckt kan genfunktion studier fokuseras inom ett mycket smalt period av utveckling. Med denna metod har vi upptäckt GFP uttryck inom så lite som tre dagar och så länge som tre månader efter injektionen. Vi har uppnått både över-uttryck och shRNA medierade knock-down av Lentiviral mikroinjektion. Denna metod ger detaljerad morfologier av OSN cell organ och axoner på enskild cell nivån in vivo och därmed möjliggör karakterisering av kandidatgener geners funktion under olfactory utveckling.

Protocol

1. Förberedelser Detta förfarande är biosäkerhetsnivå 2, därför att följande förberedelser är gjorda i ett biologiskt huva där mikroinjektion proceduren utförs. Förbered och värm en 37 ° C vattensäng: Fyll en plast förvaringsväska med vatten – tätning och ligger på en tömd värmeblock inkubator. Detta gör att möss att återhämta sig efter injektion. Fyll en biologiskt avfall behållare med 10% blekmedel till en lämplig volym för nedsän…

Discussion

Mikroinjektion av lentivirus resulterar i permanent överföring av genen konstruktioner i OSN arvsmassans DNA. Detta tillvägagångssätt tillåter oss att göra kortsiktiga eller långsiktiga manipulationer av gener via överuttryck eller shRNA medierad knock-down. Dessutom kan vi etiketten fluorescerande enda OSN i en befintlig transgen mus linje att följa co-lokalisering av befolkningen luktreceptor. Mikroinjektion krävs för Lentiviral transduktion av OSN. Vi har försökt spola lentivirus fjädring i näshålan …

Materials

Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).

Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.

Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.