Summary
Dimostriamo realizzazione di un semplice dispositivo a microfluidi che possono essere integrati con standard di configurazioni di elettrofisiologia per esporre superfici microscala di una fetta del cervello in un modo ben controllata da diversi neurotrasmettitori.
Abstract
Abbiamo dimostrato la realizzazione di due livelli dispositivo a microfluidi che possono essere facilmente integrati con configurazioni elettrofisiologia esistenti. I due livelli dispositivo a microfluidi è fabbricato con un passo a due di serie negativa resistere processo di litografia 1. Il primo livello contiene microcanali con aspirazione e scarico ad ogni estremità. Il secondo livello contiene microscala fori circolari trova a metà strada della lunghezza di canale e centrato con larghezza del canale. Passiva metodo di pompaggio è utilizzato per pompare fluidi dal tubo di ingresso alla porta di uscita 2. Il dispositivo a microfluidi è integrato con off-the-shelf camere di perfusione e consente una perfetta integrazione con l'impostazione di elettrofisiologia. I fluidi presentata al flusso di ingresso porte attraverso i microcanali verso i porti di uscita e di fuga attraverso le aperture circolari situato sulla parte superiore del microcanali nel bagno della perfusione. Così la superficie inferiore della fetta cervello nel bagno camera di perfusione e sopra il dispositivo a microfluidi può essere esposto con i neurotrasmettitori diversi. Lo spessore del dispositivo microscala microfluidica e trasparente la natura dei materiali [vetro coprioggetto e PDMS (polidimetilsilossano)] usato per fare il dispositivo a microfluidi permettono microscopia della fetta cervello. Il dispositivo a microfluidi consente la modulazione (sia spaziale e temporale) degli stimoli chimici introdotti microambienti fetta del cervello.
Protocol
SU-8 stampo di fabbricazione
Maestro preparazione
- Il SU-8 master sul substrato di wafer di silicio viene preparato utilizzando un due fasi di serie negativa resistere processo di litografia.
- I segni di allineamento sul wafer di silicio vengono rimossi con una lametta come l'altezza di queste strutture (che si trova lungo il perimetro esterno del wafer) è più che le strutture di dispositivo reale.
- Il wafer di silicio viene poi pulita con alcool isopropilico e asciugato in un flusso di N 2. Pilastri di sostegno fatto di nastro con spessore inferiore della struttura più alta dispositivo sostituire i contrassegni di allineamento sui quattro lati del wafer.
Nota: Se l'altezza di supporto pilastri è più che le strutture di più alto dispositivo, attraverso i fori non si formano nello stampo PDMS. - Il wafer di silicio master è collocato su una piastra calda a temperatura ambiente.
PDMS soluzione di preparazione
- Quattro grammi di polidimetilsilossano (PDMS) soluzione viene preparata grazie alla miscelazione 10 parti di elastomero di silicone con 1 parte di catalizzatore.
Nota: Assicurarsi che le due soluzioni vengono mescolate in modo uniforme per ottenere simili proprietà fisiche in tutto lo stampo PDMS. - Le bolle generate nella soluzione PDMS durante il processo di miscelazione vengono rimossi con un essiccatore a vuoto.
PDMS rivestimento e la cura
- La bolla senza soluzione di PDMS sta lentamente erogata sul SU-8 maestro assicurandosi che le bolle non sono generati durante il processo di erogazione.
- Un termine di una scrittura su pellicola trasparente viene posto sulla piastra riscaldante e lentamente immessi sul PDMS soluzione per diffondere uniformemente il PDMS sul SU-8 master. Eventuali bolle d'generati durante questo processo devono essere rimossi mediante una sonda.
[Nota: Non sollevare la trasparenza per impedire la produzione di più bolle.] - Una lastra Borofloat è posto sulla parte superiore del foglio di trasparenza per applicare una pressione uniforme. Leggera pressione viene applicata sulla superficie superiore del più alto strutture circolari (che si trova a metà strada della lunghezza di canale e centrato tutta la larghezza dei canali) tale che non vi è minima o nessuna PDMS inserita tra la trasparenza e il SU-8 superficie della circolare strutture.
- Tre lastre Borofloat più sono posti sulla parte superiore del sandwich di wafer di silicio-Borofloat lastra di applicare una pressione costante sulla superficie superiore delle strutture apertura circolare prima e durante il processo di polimerizzazione.
- La temperatura della piastra calda viene poi aumentata a 75 ° C e il PDMS è curata a questa temperatura per 1 ora. La piastra calda è portato ad una temperatura di 50 ° C.
- Le lastre vengono rimosse e la trasparenza viene delicatamente rimosso lasciando il master e il foglio sottile PDMS rivestito su di esso.
La costruzione del dispositivo a microfluidi
Rimozione del foglio PDMS da maestro
- Il confine esterno della camera di perfusione è scolpito sul foglio PDMS con una lama di rasoio dopo aver allineato le porte della camera di perfusione con i porti sul SU-8 master.
- Il foglio PDMS viene poi delicatamente rimosso dal maestro, tirando su tutta la lunghezza dei canali per evitare strappi di PDMS. Il foglio PDMS è posizionato su un foglio trasparente con la superficie della rete microfluidica verso l'alto.
- Le porte di entrata e di uscita sono poi effettuata utilizzando un piralide del sughero.
Incollaggio di fogli PDMS al vetro coprioggetto
- La superficie di incollaggio del foglio PDMS (la superficie che contiene la rete microfluidica) e un coprioggetto di vetro vengono poi delicatamente puliti con un nastro adesivo 3M, posta su un foglio di trasparenza e, infine, collocato nella camera 2 O plasma.
- Le superfici interessate sono trattate con 165 Watt plasma per 10 s. La superficie trattata al plasma del vetrino di vetro è subito incollata alla superficie trattata al plasma del foglio PDMS.
Nota: Applicare una leggera pressione sulla superficie del vetro per eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate tra le superfici di incollaggio. - A 5 minuti di ottenere una buona aderenza tra il PDMS e vetro. Dopo 5 minuti rimuovere delicatamente la trasparenza su cui è stato posto il foglio PDMS per il processo di incollaggio.
- Il dispositivo a microfluidi viene inserito nel sistema di plasma di ossigeno per rendere i canali idrofili. Il trattamento al plasma è fatto a 165 Watt per 1 minuto.
Integrazione di dispositivo a microfluidi e da camera perfusione
Preparazione della camera di perfusione
- Un off-the-shelf camera di perfusione è stato ordinato, e le porte di ingresso e di uscita sono stati perforati in modo che quando il dispositivo microfluidica e la camera sono legati, le porte della camera e il dispositivo siano allineati. La superficie inferiore della camera di perfusione è rivestita con PDMS di ottenere una perfetta tenuta tra la camera e il dispositivo a microfluidi.
- Una scrittura su un foglio trasparente viene posto su una piastra calda a temperatura ambiente.
- Un grammo PDMS soluzione viene preparata in un processo simile a quello descritto in precedenza. La bolla senza soluzione di PDMS è poi lentamente erogato sulla generazione foglio trasparenza evitando di bolle.
- La camera di perfusione viene posto sulla soluzione PDMS.
- Una lastra Borofloat viene posto sulla parte superiore della camera di applicare una pressione uniforme e di ottenere uno strato sottile di PDMS sulla superficie inferiore della camera.
- La temperatura della piastra calda viene poi aumentata a 75 ° C e il PDMS è curata a questa temperatura per 1 ora.
Incollaggio di dispositivo a microfluidi e da camera perfusione
- La lastra viene rimosso e la trasparenza viene delicatamente rimosso lasciando la camera di perfusione e la sottile lamiera PDMS sulla sua superficie inferiore. Indesiderati PDMS è rimosso con una lama di rasoio e una sonda punta acuminata per la rimozione PDMS da porte di accesso.
- La superficie PDMS del dispositivo microfluidica e la superficie inferiore PDMS della camera sono poi delicatamente puliti con un nastro 3M, posto su un foglio di trasparenza e, infine, collocato nella camera di plasma di ossigeno.
- Le superfici sono trattate con 165 Watt plasma per 10 s. La superficie rivestita PDMS della camera è immediatamente incollata alla superficie PDMS del dispositivo a microfluidi.
Nota: Applicare una leggera pressione sulla superficie del vetro per eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate tra le superfici di incollaggio. - Immediatamente prima dell'uso, il dispositivo viene inserito nel sistema di plasma di ossigeno per rendere i canali idrofili. Il trattamento al plasma è fatto a 165 Watt per 1 minuto.
L'esposizione fettine di cervello di microambiente neurochimiche utilizzando il dispositivo a microfluidi
- Il microcanali idrofilo del (dispositivo a microfluidi) - (camera di perfusione) combinazione sono pieni di serie ACSF (Artificial fluido cerebro-spinale) soluzione.
- Dispensare piccole gocce di soluzione ACSF nei porti di entrata e lasciare che la soluzione deve essere malvagio fino nei canali. Eliminare eventuali bolle d'sinistra utilizzando una siringa dal foro di uscita. Dispensare una grossa goccia di soluzione ACSF alla porta di uscita per permettere il pompaggio passivo di fluidi da entrata a uscita del dispositivo microfluidica.
Nota: Si deve prestare attenzione a rimuovere tutte le bolle dai canali per consentire il flusso dei fluidi utilizzando il metodo passivo di pompaggio. - Fissare il (dispositivo a microfluidi) - (camera di perfusione) combo nella piattaforma pianura e fissare la piattaforma comune nel adattatore per microscopio.
- Collegare l'ingresso standard e scarico (aspirazione) tubo alla camera di perfusione per perfusione continua della fetta cervello con soluzione standard ACSF. La soluzione ACSF è continuamente aspirato con il 95% O2-5% di CO 2.
Nota: Regolare la posizione del tubo di aspirazione per mantenere costante il livello di ACSF nel bagno della camera di perfusione. - Una volta che la camera di perfusione è riempita con una soluzione ACSF, una fetta del cervello nella camera di perfusione con un contagocce. Utilizzando una sonda, la posizione la fetta cervello sopra le aperture circolari nel dispositivo microfluidica. Una volta che la fetta cervello è nella posizione desiderata sopra le aperture circolari, utilizzare un ancoraggio fetta per immobilizzare la fetta cervello.
- Il dispositivo a microfluidi può ora essere utilizzato per esporre le fette di cervello (posto nella camera di perfusione e sulla parte superiore della rete microfluidica) per vari neurotrasmettitori utilizzando passiva pompaggio di fluidi.
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Discussion
Macroscala esistenti o microscala perfusione cerebrale camere fetta sono limitati in termini di risoluzione spaziale che forniscono ad esporre fettine di cervello di neurotrasmettitori. La tecnologia microfluidica dispositivo dimostrato qui supera questa limitazione utilizzando semplici tecniche bioMEMS. Si prevede che la semplicità nella fabbricazione del dispositivo microfluidica e la facilità di integrazione con esistenti configurazioni elettrofisiologia permetterà l'applicazione diffusa della tecnologia dei dispositivi dimostrata. Esperimenti interessanti che non erano possibili in precedenza possono essere eseguite con il dispositivo corrente microfluidica. Microambienti diversi della fetta cervello può essere esposto a diversi neurotrasmettitori in diverse scale temporali. Il dispositivo prototipo attuale comprende solo quattro canali paralleli e aperture circolari situati uno accanto all'altro. Tuttavia, questa disposizione dispositivo può essere facilmente modificata mediante l'attuazione di diversi modelli che sarebbero aperture di diverse forme o dimensioni, o il microcanali potrebbe essere serpeggiava in un modo che avrebbe portato al posizionamento delle aperture in differenti microambienti di fette di cervello.
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Disclosures
Gli autori sono aperti a collaborazioni che coinvolgono la tecnologia microfluidica dimostrato per diversi campi della biologia.
Acknowledgments
Il finanziamento è stato fornito dal NIH MH-64611 e NARSAD premio Young Investigator. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Adam Beagley, Mark Dikopf, e Ben Smith, per la loro assistenza tecnica.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-26GPL | Tool | Warner Instruments | W2-64-0236 | Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber |
| SHD-26GH/10 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0253 | Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit |
| Plasma Preen-II 862 | Tool | Plasmatic Systems, Inc. | Microwave plasma system | |
| Model P-1 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0277 | Series 20 Plain Platform, Model P-1 |
| SA-NIK | Tool | Warner Instruments | W2-64-0291 | Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK |
| Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid) | Reagent | Exact composition will vary with application |
References
- Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment. Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).
- Walker, G. M., Beebe, D. J. A passive pumping method for microfluidic devices. Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).
