Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التصوير G - مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) بوساطة الأحداث يشير إلى أن التحكم في الانجذاب الكيميائي Dictyostelium Discoideum Published: September 20, 2011 doi: 10.3791/3128
Automatic Translation
1, 1
1Chemotaxis Signal Section, Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

Summary

هنا ، نحن تصف تفصيلا التصوير الخلية الحية أساليب التحقيق الكيميائي. نقدم أساليب مضان المجهري لرصد ديناميات spatiotemporal من الأحداث يشير في الخلايا المهاجرة. قياس الأحداث يشير يسمح لنا أن نفهم كذلك كيف شبكة النوع من الاختزال ، يشير يحقق التدرج الاستشعار من chemoattractants وضوابط الهجرة الاتجاه من الخلايا حقيقية النواة.

Abstract

ويمكن الكشف عن العديد من الخلايا حقيقية النواة التدرجات الاشارات الكيميائية في بيئاتهم ، وترحيل 1 تبعا لذلك. ويشار إلى هذه الهجرة كما قاد الخلية الكيميائي ، وهو أمر ضروري للخلايا مختلفة لتنفيذ وظائفها مثل الاتجار الخلايا المناعية والخلايا العصبية الزخرفة 2 ، 3. عائلة كبيرة من البروتين G - مستقبلات مقترنة (GPCRs) بالكشف عن الببتيدات الصغيرة متغير ، والمعروفة باسم chemokines ، لتوجيه الهجرة خلية في الجسم الحي 4. الهدف النهائي للبحث الكيميائي هو أن نفهم كيف يمكن لchemokine التدرجات GPCR آلات الحواس وإشارات التحكم الأحداث التي أدت إلى الكيميائي. GPCR بوساطة لتحقيق هذه الغاية ، ونحن نستخدم تقنيات التصوير للمراقبة ، في الوقت الحقيقي ، وتركيزات spatiotemporal الحركة chemoattractants الخلية ، في التدرج من جاذب كيميائي ، وتفعيل heterotrimeric البروتين G ، وإشارات بين الخلايا المشاركة في الأحداث الكيميائي للخلايا حقيقية النواة 5-8 . الكائن بسيطة حقيقية النواة ، Dictyostelium discoideum ، يعرض chemotaxic السلوكيات التي هي مماثلة لتلك الكريات البيض ، ودال. discoideum هو نظام نموذجي لدراسة مفتاح الكيميائي حقيقية النواة. كما حرر المعيشة الأميبات ، D. الخلايا في الانقسام discoideum المتوسط ​​الغنية. عند الجوع ، والخلايا إدخال برنامج التنموي الذي والتجميعية من خلال cAMP في بوساطة الكيميائي لتشكيل هياكل multicullular. وقد تم تحديد العديد من العناصر المشتركة في الكيميائي إلى مخيم في دال discoideum. الربط من المخيم إلى GPCR (cAR1) يدفع تفكك heterotrimeric G - البروتينات إلى وحدات فرعية Gγ Gβγ 7 و 9 و 10. Gβγ مفارز تنشيط رأس ، والذي ينشط في PI3K بدوره تحويل PIP 2 إلى 3 PIP على غشاء الخلية 11-13. 3 PIP بمثابة مواقع ملزم للبروتينات مع التماثل pleckstrin (PH) المجالات ، وبالتالي توظيف هذه البروتينات إلى غشاء 14 و 15. تفعيل مستقبلات cAR1 يتحكم أيضا في الجمعيات غشاء PTEN ، التي dephosphorylates PIP PIP 2 3 إلى 16 و 17. يتم الحفاظ تطويريا الآليات الجزيئية في الكيميائي GPCR chemokine بوساطة الخلايا البشرية مثل العدلات 18. نقدم الطرق التالية لدراسة الكيميائي د. discoideum الخلايا. 1. إعداد الخلايا المكون الكيميائي. 2. التصوير الكيميائي للخلايا في الانحدار المخيم. 3. تراقب تفعيل GPCR الناجم عن heterotrimeric G - البروتين في الخلايا الحية واحد. 4. تصوير جاذب كيميائي عن العوامل الدينامية PIP 3 الردود في الخلايا الحية واحد في الوقت الحقيقي. ويمكن تطبيق أساليب التصوير المتقدمة لدينا لدراسة الكيميائي من الكريات البيض البشرية.

Protocol

1. إعداد الخلايا المختصة الكيميائي من discoideum Dictyostelium

  1. لتوليد الخلايا التي يتم discoideum دال الكيميائي إلى معسكر جاذب كيميائي ، وخلايا الحصاد المتزايد في D3 - T الوسائط الغنية من ثقافة الهز حتى 22 درجة مئوية.
  2. يغسل مرتين في الخلايا غير المغذيات العازلة التنموية (DB العازلة التي تحتوي على 5 مم نا 2 هبو 4 ، 5 مم KH 2 PO 4 ، 2 مم MgCl 2 و 0.1 ملم CaCl 2).
  3. اعادة تعليق الخلايا في DB العازلة في مناطق ذات كثافة الخلايا 2x10 7 / مل.
  4. هزة 10 مل الخلايا في قارورة 250 مل بسعر 100 دورة في الدقيقة عند 22 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
  5. تسليم 100 ميكرولتر من 7.5 ميكرومتر الأسهم المخيم إلى الخلايا 10 مل كل ست دقائق أكثر من 6 ساعات لتحقيق تركيز النهائي من مخيم نانومتر 75 ، وهي عملية تسمى العلاج cAMP في النبض. بعد 5-6 ساعات من العلاج cAMP في النبض ، D. تصبح الخلايا discoideum الكيميائي المختصة الانحدار نحو المخيم.
  6. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 غ لمدة 5 دقائق ثم مع الخلايا resuspend العازلة DB تحتوي على مادة الكافيين 2.5 ملم ، ويهز بسرعة 200 دورة في الدقيقة في 22 دقيقة لمدة 20 درجة مئوية لbasolate الخلية إلى حالة الانجذاب الكيميائي.

2. تصوير الخلايا chemotaxing في الانحدار وضوحا وجاذب كيميائي manipulatable

  1. الردم a micropipette بمحلول الطازجة 30 ميكرولتر من مخيم ميكرومتر (1) واليكسا 594 في 0.1μg/μl العازلة في DB.
  2. إرفاق Femtotip إلى حائز micropipette وتوصيل الأنابيب لضغط جهاز العرض ، إيبندورف FemtoJet النظام.
  3. إرفاق التجمع micropipette إلى micromanipulator (إيبندورف TransferMan nk2 إليه) بمحركات micromanipulator لتوفير الضغط المستمر من أجل إقامة التدرج مستقرة.
  4. جبل LabTek غرفة واحدة مليئة جيدا 6 مل من العازلة DB عبر عدسة النفط 40X على مبائر واستخدام المجهر مشرق حقل البصريات ، مركز Femtotip في مجال الرؤية.
  5. بدوره على توريد مجموعة الضغط والضغط التعويض (PC) لمدة 70 هكتوبسكال لإنشاء التدرج من خليط 594 المخيم / اليكسا.
  6. تصور التدرج المخيم رصد خليط من التركيز المطلوب من المعسكر واليكسا 594 مضان به الإثارة مع خط ليزر 543 نانومتر.
  7. استخدام السيارات لتحديد المواقع وظيفة من micromanipulator لوضع micropipette إلى المواقع المطلوبة والمنصوص عليها في المركز 1 ، 2 موقف ، والموقف من 3 إلى التلاعب التدرج الخلية التي يتعرضون إليها.

3. نظام متحرك الخلية nonpolarized يسهل تصوير الأحداث يشير الى المشاركة في مخيم التدرج الاستشعار

  1. بعد العلاج الكافيين ، وإزالة الخلايا وقسامة الطرد المركزي في 500G لمدة 3 دقائق.
  2. إزالة العازلة وتمييع الخلايا إلى خلايا 5x10 5 / مل مع العازلة DB الطازجة التي تحتوي على الكافيين 2.5 مم.
  3. 1 مل من تطبيق تعليق خلية إلى مجلس واحد بشكل جيد أو 0.4 مل لكل جانب من الغرفة أربعة جيدا.
  4. يسمح للخلايا الالتزام لمدة 10 دقيقة ، ماصة بعناية قبالة عازلة لإزالة الخلايا غير مرتبط واستبدالها مع نفس الحجم.
  5. تحديد الخلايا المطلوب تحت المجهر وبدء التصوير.
  6. عن تجربة صممت لرصد ديناميات إشارات المكونات في تعريض الخلايا إلى الانحدار المستمر ، وعلاج الخلايا مع 5.0 ميكرومتر (تركيز النهائي) Latrunculin باء لمدة 10 دقيقة قبل التجارب.

4. في نفس الوقت رصد بروتين G heterotrimeric التنشيط والإنتاج PIP 3

  1. cAMP في تطوير خلايا النبض المشترك معربا عن GαCFP وYFPGβ (خلايا G) والخلايا معربا عن PIP مؤشر PH - 3 GFP (خلايا PH) 7.
  2. مزيج هذين النوعين من الخلايا التي تحتوي على نسبة 1:1 ومنها لوحة واحدة في غرف أو 4 بشكل جيد جيدا.
  3. إنشاء وحفظ المرجع بصمة الانبعاثات منحنى CFP ، وYFP GFP امبدا باستخدام النمط اقتناء المكدس داخل النطاق الطيفي 464-624 نانومتر مع عرض 10 نانومتر.
  4. في وقت واحد من البروتين G تنشيط الخلايا في صورة PIP 3 G والإنتاج في الخلايا باستخدام PH مع نفس النمط امدا المكدس اقتناء ضمن النطاق الطيفي 464-544 نانومتر مع زيادات 10 نانومتر.
  5. تطبيق الدالة الخطية Unmixing البرمجيات 510META زايس به حفظ CFPand YFP وبصمات الأصابع لحساب الانبعاثات رياضيا مساهمة كل fluorophore في المكدس لامدا لفصل CFP وكثافة YFP إلى القنوات الفردية في G.
  6. مع الاستراتيجية ذاتها ، وتطبيق وظيفة Unmixing الخطي باستخدام GFP والبصمات المحفوظة الانبعاثات الخلفية لحساب كثافة حسابيا GFP PH في الخلايا.

5. ممثل النتائج :

  1. نظام نموذجا ممتازا للدال discoideum الكيميائي للتوسط النوع من الاختزال. الاميبا والاجتماعية ، د. المعارض discoideum a الكيميائي ضرب خلال دورة الحياة. نظرا لمزاياه الوراثية والبيوكيميائية ، D. د يوفر بقوتهاystem لدراسة الكيميائي.
  2. الكيميائي للخلايا في إطار مجالات chemoattract المرئية وmanipulatable ، وهنا نعرض أولا منهجية بسيطة للحصول على وجود علاقة خطية بين معسكر اعتقال وكثافة من صبغة الفلورسنت اليكسا 594 سلسلة التخفيف من مخيم 2 ميكرومتر مختلطة مع 10 ميكروغرام / مل الكسا 594 (الشكل 2A). المقبل ، ونحن نقدم وسيلة سهلة لتصور التدرج ، وعلاوة على ذلك ، لإنشاء القياس الكمي للتركيز معسكر متدرجة من شدة اليكسا 594 (الشكل الشكل 2B).
  3. هو uncoupled حركية الخلية مع خلية الاستقطاب والاستشعار عن اتجاهي. مثبط بلمرة أكتين يلغي موجودة من قبل الأقطاب المورفولوجية ويمنع أيضا حركة الخلية مع الحفاظ على قدرة الخلايا الاستشعار عن الاتجاه (الشكل 3A). توظيف cAMP في التحفيز وضوحا وmanipulatable يضمن المدخلات ، والتحفيز على سبيل المثال تطبق بشكل موحد أو التدرج ملف. هذا الأسلوب يسمح التحليل الكمي في مخيم الناجم عن إعادة توزيع المكونات الرئيسية يشير التدرج في آلية الاستشعار عن بعد. ديناميات spatiotemporal يقاس من هذه المكونات إشارة تتيح لنا أن نفهم كيف يمكن للشبكة يشير يحقق التكيف مع التحفيز موحدة في حين تولد ردود البيوكيميائية الاستقطاب إلى التدرجات (الشكل 3B).
  4. القياسات المنتظمة لحركية chemosensing شبكة الإشارات عند التعرض إلى الانحدار ثابتة. ومن المهم للغاية لقياس ديناميكية / حركية الاتجاه الاستشعار إشارات لفهم كيفية مكونات كل عنصر يساهم في إنشاء خلايا الاستقطاب بين الخلايا عند تجربة التدرج الأول. تطبيق التصوير الخلية الحية مع دقة عالية الإيقاع المكاني ، وتبين لنا لأول مرة ثنائي الطور PIP3 إنتاج الخلايا التي تتعرض لcAMP في الانحدار المستمر (الشكل 4A - C). تطبيق الخلية الحية التصوير ، فقد قمنا بقياس منهجية ديناميكية محددة الاتجاه الاستشعار عن التحفيز يشير شبكة المخيم لPIP3 الإنتاج (الشكل 4D ، E).
  5. في نفس الوقت رصد بروتين G heterotrimeric التنشيط والإنتاج 3 PIP على تحفيز cAMP في تطبيقها بشكل موحد. فورستر بالرنين نقل الطاقة (مختصر الحنق) على نهج فعالة لرصد heterotrimeric تنشيط بروتين G (التفكك) على تحفيز المخيم. هنا ، وصفت لدينا خبير مريحة سهلة تعتمد نظام لقياس متزامنة من heterotrimeric تنشيط بروتين G و 3 PIP الإنتاج من خلال رصد التغيير والحنق إزفاء غشاء PIP 3 التحقيق ، PH - G في GFP PH والخلايا ، على التوالي (الشكل رقم 5 ). والتحفيز cAMP في تطبيقها بشكل موحد على بروتين يطلق G التنشيط المستمر الذي يتسبب في حين عابرة PIP 3 الإنتاج.

الشكل 1
الشكل 1 : وجود نظام نموذجا ممتازا للدال discoideum الكيميائي للتوسط النوع من الاختزال. ألف مخطط يبين مسار إشارات موجزة للاستشعار عن اتجاهي. باء cAMP في الانحدار السريع يدفع الكيميائي د. discoideum الخلايا. 3 التعبير عن الخلايا PIP التحقيق ، PH - GFP (الخضراء). التدرج (الأحمر) هو تصور من قبل اليكسا 594. مقياس شريط = 50μm.

الشكل 2
الشكل 2 : الانجذاب الكيميائي للخلايا في إطار مجالات chemoattract المرئية وmanipulatable. رسم بياني يظهر A. وجود علاقة خطية بين معسكر اعتقال وكثافة وجود صبغة الفلورسنت اليكسا 594 سلسلة التخفيف من مخيم 2 ميكرومتر مختلطة مع 10 ميكروغرام / مل اليكسا 594. باء القياس الكمي لمعسكر الاعتقال متدرجة من علاقة خطية تركيز المخيم وكثافة اليكسا صبغة الفلورسنت 594 ألف في

الشكل 3
الرقم 3 : uncoupled حركية الخلية مع خلية الاستقطاب والاستشعار عن اتجاهي. ألف صورة متحركة تظهر أن الخلايا من معاملة المانع أكتين البلمرة Latrunculin باء الحفاظ على القدرة على الاستشعار عن اتجاهي. 3 التعبير عن الخلايا PIP التحقيق ، PH - GFP (الخضراء). التدرج (الأحمر) هو تصور من قبل اليكسا 594. باء Manipulatable الخلية التحفيز ونظام المحتشد متحرك يسمح لمعالجة المسائل الرئيسية للاستشعار عن اتجاهي. مقياس شريط = 10μm.

الشكل 4
الشكل 4 : قياسات الجهازية للحركية chemosensing شبكة الإشارات عند التعرض إلى الانحدار ثابتة. ألف المونتاج يظهر ثنائي الطور PIP 3 الإنتاج (الأخضر) من الخلايا التي تتعرض لcAMP في الانحدار المستمر (الأحمر). باء صورة تظهر مناطق المصالح (رويس) لقياس حركية الإنتاج المقدمة في 3 PIP C C. . حركية سPIP و 3 في إنتاج الخلايا المعرضة للتدرج لوني ثابت. دال مخطط يوضح شبكة الإشارات الاستشعار عن الاتجاه من المخيم إلى تحفيز إنتاج 3 PIP. ويرد حركية سفرهم عند التعرض لالانحدار المستمر في خطوط نفس اللون الصلبة في البريد.

الشكل 5
الشكل 5 : رصد متعددة في وقت واحد من الأحداث يشير الى شبكات النوع من الاختزال. ألف مخطط يبين قياس المتزامن لتنشيط بروتين G heterotrimeric PIP والإنتاج 3 عن طريق رصد التغيير والحنق إزفاء غشاء التحقيق PIP3 ، PH - G في GFP PH والخلايا ، على التوالي. باء مونتاج للصور من مجموعة قوس قزح والخلايا PH معارض ان تحفيز cAMP في تطبيقها بشكل موحد على بروتين يطلق G التنشيط المستمر على طرفي الخلية ، في حين أن الذي يتسبب في إنتاج PIP3 عابرة. النقاط وقت قبل (0s) وبعد لتحفيز 10.2s ، 4.9s و20.4s جيم حركية تنشيط بروتين G PIP3 وبناء على تحفيز الانتاج cAMP في تطبيقها بشكل موحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

العمليات للوصول إلى مرحلة من الخلايا المختصة الكيميائي

لنوع البرية D. discoideum الخلايا ، فإنه يأخذ حوالي 5 ~ 6 ساعات ينبض التنمية في درجة حرارة الغرفة لدفعهم الى مرحلة جيدة الكيميائي المختصة خلال الخلايا التي تعرض التشكل جيدا الخلوية والاستقطاب السريع الهجرة الخلية (الشكل 1). قد عدة عوامل ، مثل مخيم للتركيز النبض ودرجة الحرارة وخلفيات وراثية مختلفة ، تؤثر على عملية التوصل إلى مرحلة المختصة الكيميائي. ودلائل التدرج معسكر الخلايا للتحرك في اتجاه مصدر المخيم ، هجرة الخلايا الموجهة تسمى الكيميائي. ومع ذلك ، قد الخلايا التي لم تصل بعد إلى مرحلة الانجذاب الكيميائي المختصة بسبب التنمية غير كافية أو خلفيتهم الوراثية لا تظهر سمتين النموذجية : مورفولوجيا الاستقطاب السريع وحركة الخلية. من ناحية أخرى ، والخلايا التي مرت مرحلة الانجذاب الكيميائي المختصة بسبب التنمية في كثير من الأحيان على شكل كتل من الخلايا ، والتي هي صعبة جدا لفصل إلى الخلايا الفردية للتجارب التصوير..

1. تصوير الخلايا chemotaxing في الانحدار وضوحا وجاذب كيميائي manipulatable

بل هو التقدم التقني لتطبيق التحفيز جاذب كيميائي fluorescently المسمى وmanipulatable إلى نظام التجريبية. تاريخيا ، كان لدينا تطبيق إما تحفيز تطبيق متجانس (وتسمى أيضا تحفيز موحدة) التدرج أو التحفيز لمراقبة مورفولوجيا الخلايا والسلوكيات. ومع ذلك ، فإن "العمياء" التحفيز لا يظهر أي معلومات تيرة المكانية على كيفية المنبهات تصل الخلايا ، ويلقي ظلالا من الشك على ذلك أي ملاحظات "غير طبيعي" من الاستجابات الخلية. هنا ، نظهر تطبيق صبغة الفلورسنت (Alexa594 ، دقق الجزيئية) مع جاذب كيميائي لإقامة علاقة خطية بين تركيز جاذب كيميائي وكثافة يوم الفلورسنت رصدها و(الشكل 2A ، B). مزيج من البروتين اكتساب الفلورية الخضراء (GFP) والانبعاثات صبغ أحمر فلوري (Alexa594) الذي يسمح لنا بمراقبة كلا من التحفيز والردود على هذا التحفيز الخلية (الشكل 2C).

وفقا لمتطلبات التجريبية ، وهناك أكثر مجموعات المتاحة. في حين تنظر صبغة الفلورسنت الجديدة ، من المهم جدا للتأكد من الفلورسنت هي مناسبة لتجربتك ، وخاصة بالنسبة للتجربة التدرج ، فمن المهم لتأكيد المشاركة في نشر كفاءة من المحفزات الخاص وصبغة الفلورسنت. أيضا ، من أجل الحصول على علاقة خطية من تركيز المنبهات وشدة صبغ فلوري مختلطة ، فمن الضروري الحصول على أقصى تركيز المنبهات دون التشبع من الكثافة.

2. نظام متحرك الخلية nonpolarized يسهل العيش التصوير الخلية

الكيميائي هو عملية معقدة الخلوية ، ومع ذلك ، يمكن تشريح إلى ثلاثة جوانب أساسية هي : الاستقطاب الخلوية ، والحركية ، والاستشعار عن اتجاهي. شكليا ، ويشار إلى استقطاب ألف إلى إحدى الشركات الرائدة في جبهة واضحة المعالم ونهاية زائدة من خلية. يشير العديد من مكونات المشاركة في توطين الكيميائي في fornt إما الظهر أو في خلايا الاستقطاب. الاستشعار عن الاتجاه هو القدرة على خلية لترجمة التدرج خارج الخلية إلى داخل الخلايا الاستقطاب الاستقطاب البيوكيميائية. كما هو مبين في الشكل. 3A ، وعلاج الخلايا مع أكتين البلمرة المانع (Latrunculin ب) يحل بسرعة خلية حركية والاستقطاب الأصلي. لافت للنظر ، وخلايا لا تزال قادرة على إقامة الاستقطاب داخل الخلايا ، مثل تراكم PIP 3 في الجزء الأمامي من الخلايا التي تواجه الانحدار (كما هو موضح بواسطة هلال PIP3biosensor ، PH - GFP) ، مشيرا إلى أن الاستشعار عن الاتجاه من الخلايا يمكن أن تكون uncoupled من الاستقطاب والحركة الخلية الخلية. هذا النظام الخلية غير الاستقطاب يسمح لنا لتحديد حركية إشارات المكونات الأساسية لchemosensing دون مضاعفات حركية الخلية والاستقطاب السابقة. المؤيدة والمعارضة ، ومعاملة المانع بلمرة أكتين يلغي كل الديناميات التي يعولون على الهيكل الخلوي - أكتين.

3. شبكة رصد إشارات متعددة الأطياف بواسطة التصوير الخلية الحية

اشتباك في مخيم لمستقبله مشغلات تنشيط بروتين G heterotrimeric. ك في وقت لاحق ، تنأى الوحيدات Gβγ من الوحيدات Gα وينشط المستجيبات المصب للحث على الاستجابات الخلية مثل PIP3 الإنتاج. التقدم التقني في الاستبانة المكانية وتيرة الفحص المجهري للسماح الفلورسنت التصوير المتزامن لعدة أحداث على المستوى التحت خلوية الإشارات في الخلايا الحية. في هذا المقطع ، نعرض أولا التصوير المتزامن لاثنين من الجزيئات مما يشير إلى جانب رصد cAMP في الانحدار (الشكل 4A). المقبل ، نقدم التصوير الطيفي تفعيل G وردها الخلية السفلية PIP3 الإنتاج (الشكل 4B). فورستربالرنين نقل الطاقة (مختصر الحنق) ، المعروف أيضا باسم مضان بالرنين نقل الطاقة ونقل الطاقة الرنين (RET) أو لنقل الطاقة الإلكترونية (EET) ، وهو يصف آلية نقل الطاقة بين اثنين chromophores. هناك ثلاثة معايير لحدوث الحنق : تداخل الانبعاثات المانحة والإثارة متقبل ، والتوجه المناسب ، وبعد مسافة قصيرة (<10 نانومتر). شرط المسافة / التوجيه اثنين من جزيئات يسهل الحنق أن تكون وسيلة فعالة للكشف عن البروتين البروتين تفاعل أو تغيير intromolecular التشكل من البروتين. هنا ، استخدمنا شيوعا CFP / YFP الحنق الزوج (Gα-CFP/Gβ-YFP) لمراقبة تفارق دينامية للبروتين G α / βγ مفارز في الخلايا الحية. وتصميم ذكي التجريبية التي وصفناها هنا هو مزيج نوعين مختلفين من الخلايا في وقت واحد من أجل رصد كل من البروتين G التنشيط والإنتاج PIP3 عندما لا تكون مريحة لقياس ديناميكية في كل خلية واحدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويؤيد هذا العمل من قبل صندوق جماعية من NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D3-T Growth Media KD Medical
Caffeine Sigma-Aldrich
Latrunculin B Molecular Probes, Life Technologies
Alexa 594 Molecular Probes, Life Technologies
cAMP Sigma-Aldrich
ChronTrol XT programmable timer ChronTrol Corp
Miniplus 3 peristaltic pump Gilbson
Platform rotary shaker
FemtoJet microcapillary pressure supply Eppendorf
Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers Nalge Nunc international
LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope Carl Zeiss, Inc. a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens
Olympus X81 or equivalent Olympus Corporation Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
  2. Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
  3. Devreotes, P. N. G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium. Neuron. 12, 235-235 (1994).
  4. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-1 (2008).
  5. Meier-Schellersheim, M. Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method. PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).
  6. Xu, X. Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Sci Signal. 3, 71-71 (2010).
  7. Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).
  8. Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing. J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).
  9. Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis. Science. 287, 1034-1034 (2000).
  10. Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2408 (2001).
  11. Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium. J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).
  12. Li, Z. Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287, 1046-1046 (2000).
  13. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).
  14. Meili, R. Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium. EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.
  15. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells. Cell. 95, 81-81 (1998).
  16. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis. Cell. 109, 611-611 (2002).
  17. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients. Cell. 109, 599-599 (2002).
  18. Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).

Tags

علم الأحياء الجزيئية ، العدد 55 ، الانجذاب الكيميائي ، والاستشعار عن اتجاهي ، النوع من الاختزال ، PCR ، G - البروتينات ، ونقل الإشارة ،
التصوير G - مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) بوساطة الأحداث يشير إلى أن التحكم في الانجذاب الكيميائي<em> Dictyostelium Discoideum</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein… More

Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128, doi:10.3791/3128 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter