Summary
We beschrijven hier gedetailleerde live cell imaging methoden voor onderzoek van chemotaxis. We presenteren fluorescentie microscopische methoden om spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in migrerende cellen te controleren. Meting van signalering gebeurtenissen laat ons toe verder te begrijpen hoe een GPCR-signalering netwerk gradiënt sensing van chemoattractants en controles directionele migratie van eukaryote cellen bereikt.
Abstract
Veel eukaryote cellen kan detecteren hellingen van de chemische signalen in hun omgeving en migreren dienovereenkomstig 1. Deze begeleide cel migratie wordt genoemd als chemotaxis, die essentieel is voor de verschillende cellen om de uitvoering van hun functies, zoals handel in immuuncellen en patroonvorming van neuronale cellen 2, 3. Een grote familie van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) detecteert variabele kleine peptiden, bekend als chemokines, naar cel migratie direct in vivo 4. Het uiteindelijke doel van chemotaxis onderzoek is om te begrijpen hoe een GPCR machines zintuigen chemokine gradiënten en controles gebeurtenissen die leiden tot chemotaxis signalering. Daartoe hebben we beeldvormende technieken te gebruiken, in real time, spatiotemporele concentraties van chemoattractants, cel-beweging in een helling van chemoattractant, GPCR gemedieerde activering van heterotrimere G-eiwit, en intracellulaire signalisatie gebeurtenissen die betrokken zijn bij chemotaxis van eukaryote cellen 5-8 . De eenvoudige eukaryotische organisme, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic gedragingen die vergelijkbaar zijn met die van de leukocyten, en D. discoideum is een belangrijk modelsysteem voor het bestuderen van eukaryote chemotaxis. Als vrij levende amoeben, D. discoideum cellen delen in rijk medium. Bij de honger, cellen binnen te dringen een ontwikkelingsstoornis programma waarin ze totaal door cAMP gemedieerde chemotaxis naar multicullular structuren te vormen. Veel onderdelen die betrokken zijn bij chemotaxis naar het kamp zijn geïdentificeerd in D. discoideum. De binding van cAMP aan een GPCR (car1) induceert dissociatie van heterotrimere G-eiwitten in Gγ en Gβγ subeenheden 7, 9, 10. Gβγ subeenheden activeren Ras, die op hun beurt activeert PI3K, PIP 2 omzetting in PIP 3 op het celmembraan 11-13. PIP 3 dienen als bindingsplaatsen voor eiwitten met pleckstrin Homologie (PH) domeinen, waardoor werven deze eiwitten aan het membraan 14, 15. Activering van car1 receptoren controleert ook het membraan verenigingen van PTEN, die PIP 3 dephosphorylates aan PIP 2 16, 17. De moleculaire mechanismen zijn evolutionair geconserveerd in chemokine GPCR-gemedieerde chemotaxis van menselijke cellen zoals neutrofielen 18. Wij presenteren volgende methoden voor het bestuderen van chemotaxis van D. discoideum cellen. 1. Voorbereiding van chemotactische component cellen. 2. Imaging chemotaxis van cellen in een cAMP verloop. 3. Het bewaken van een GPCR geïnduceerde activatie van heterotrimere G-eiwit in een levende cellen. 4. Imaging chemoaantrekkende-triggered dynamische PIP 3 antwoorden in enkele levende cellen in real time. Onze ontwikkelde beeldvormende technieken kunnen worden toegepast op chemotaxis van menselijke leukocyten te bestuderen.
Protocol
1. De voorbereiding van chemotactische competente cellen van Dictyostelium discoideum
- Voor het genereren van D. discoideum cellen die chemotactische aan de chemoattractant cAMP-, oogst-cellen groeien in D3-T rijke media van een trillende cultuur bij 22 ° C.
- Twee keer wassen van de cellen in de niet-voedingsstoffen ontwikkeling buffer (DB buffer met 5 mM Na 2 HPO 4, 5 mM KH 2 PO 4, 2 mM MgCl 2, en 0,1 mM CaCl 2).
- Re-schorten cellen in DB buffer bij een dichtheid van 2x10 7 cellen / ml.
- Schud 10 ml cellen in een 250 ml kolf bij 100 tpm bij 22 ° C gedurende een uur.
- Lever 100 pi van 7,5 uM cAMP voorraad hebben voor de 10 ml cellen om de zes minuten over zes uur tot een uiteindelijke concentratie van 75 nM cAMP, een proces dat aangeduid als cAMP pulserende behandeling te realiseren. Na 5-6 uur van cAMP pulserende behandeling, D. discoideum cellen worden chemotactische bevoegde in de richting van cAMP verloop.
- Verzamel cellen door centrifugeren bij 200 g gedurende 5 minuten en daarna resuspendeer cellen met DB buffer die 2,5 mM cafeïne, en schud bij 200 tpm bij 22 ° C gedurende 20 minuten aan cel basolate naar een chemotactische situatie.
2. Imaging chemotaxing cellen in een zichtbaar en manipuleerbaar chemoattractant gradiënt
- Backfill een micropipet met een vers bereide 30 ul oplossing van 1 uM cAMP en Alexa 594 op 0.1μg/μl in DB buffer.
- Bevestig de Femtotip om een micropipet houder en sluit de slang aan op een druk leveren apparaat, Eppendorf FemtoJet systeem.
- Bevestig de micropipet montage aan een micromanipulator (Eppendorf TransferMan NK2) gemotoriseerde micromanipulator om een constante druk te verstrekken om een stabiele gradiënt vast te stellen.
- Monteer een een-goed LabTek kamer gevuld met 6 ml van DB buffer meer dan een 40X olie lens op een confocale microscoop en gebruik van licht-field optiek, het centrum van de Femtotip in het gezichtsveld.
- Schakel de druk van het aanbod en stel de vergoeding druk (Pc) voor 70 hPa tot een gradiënt van het cAMP / Alexa 594 mengsel vast te stellen.
- Visualiseer cAMP gradiënt door het bewaken van het mengsel van de gewenste concentratie van cAMP en Alexa 594 fluorescentie excitatie met behulp van een 543 nm laser lijn.
- Gebruik de auto-positionering functie van de micromanipulator om micropipet te maken aan de gewenste posities en ze in te stellen als positie 1, positie 2 en positie 3 tot en met het verloop om welke cel worden blootgesteld aan te manipuleren.
3. Immobiele ongepolariseerde cell imaging systeem vergemakkelijkt signalisatie gebeurtenissen die betrokken zijn bij cAMP gradiënt sensing
- Na de cafeïne de behandeling, het verwijderen van een hoeveelheid van cellen en centrifugeer bij 500g gedurende 3 minuten.
- Verwijder de buffer en verdun cellen 5x10 5 cellen / ml met vers DB buffer met 2.5 mM cafeïne.
- Breng 1 ml celsuspensie aan een single-kamer goed of 0,4 ml aan elke well van een vier-kamer goed.
- Laat cellen om zich te houden gedurende 10 min, voorzichtig pipet uit de buffer om losse cellen te verwijderen en met hetzelfde volume te vervangen.
- Zoek de gewenste cellen onder de microscoop en start beeldvorming.
- Voor een experiment ontworpen om de dynamiek van signalering componenten in de cellen bloot te stellen aan een constante helling bewaken, te behandelen van de cellen met 5,0 uM (eindconcentratie) Latrunculin B gedurende 10 minuten voorafgaand aan de experimenten.
4. Gelijktijdige monitoring heterotrimere G-eiwit activering en PIP 3 productie
- cAMP pulserende ontwikkelen van cellen die co-expressie GαCFP en YFPGβ (G-cellen) en de cellen die PIP 3 indicator PH-GFP (PH-cellen) 7.
- Vermeng deze twee soorten cellen met 1:1-verhouding en de plaat ze in een goed-of 4-kamers goed.
- Maken en opslaan van de emissie-vingerafdruk referentiecurve CFP, GFP en YFP gebruik van Lambda Stack Overname mode binnen het spectrale bereik 464 tot 624 nm met een 10 nm breed.
- Tegelijkertijd afbeelding G-eiwit activering in G-cellen en PIP 3 productie in PH cellen met behulp van met dezelfde Lambda Stack Overname mode binnen het spectrale bereik 464 tot 544 nm met een 10 nm stappen.
- Van toepassing Lineair unmixing functie van Zeiss 510META software met behulp van opgeslagen CFPand YFP en emissie-vingerafdrukken wiskundig berekenen van de bijdrage van elke fluorofoor in de Lambda Stack voor het gemeenschappelijk visserijbeleid en YFP intensiteit in afzonderlijke kanalen in G. aparte
- Met dezelfde strategie toe te passen Lineair unmixing functie met behulp van GFP zijn opgeslagen en de achtergrond emissie vingerafdrukken wiskundig berekenen GFP-intensiteit in PH-cellen.
5. Representatieve resultaten:
- Een uitstekend modelsysteem van D. discoideum voor GPCR gemedieerde chemotaxis. Een sociale amoebe, D. discoideum vertoont een opvallende chemotaxis gedurende de levenscyclus. Door zijn genetische en biochemische voordelen, D. d biedt een krachtige enystem naar chemotaxis te bestuderen.
- Chemotaxis van de cellen onder een zichtbaar en manipuleerbaar chemoattract velden. Hier hebben we eerst laten zien een eenvoudige methodologie om een lineair verband tussen cAMP concentratie en de intensiteit van een fluorescente kleurstof Alexa 594 door een verdunningsreeks van 2 uM cAMP gemengd met 10 ug / ml te verkrijgen Alexa 594 (Fig. 2A). Vervolgens bieden wij een eenvoudige manier om de gradiënt bovendien visualiseren,, om een kwantitatieve meting van cAMP concentratie van een gradiënt vast te stellen door de intensiteit van de Alexa 594 (Fig. Fig. 2B).
- Celbeweeglijkheid is ontkoppeld met cel polarisatie en directionele sensing. Een actine polymerisatieremmer elimineert reeds bestaande morfologische polariteit en voorkomt ook celbeweging met behoud van de cellen 'capaciteit van directionele sensing (Fig. 3A). Werkgelegenheid van zichtbare en manipuleerbaar cAMP stimulatie garandeert de ingang, bijvoorbeeld uniforme wijze wordt toegepast stimulaties of een verloop. Deze methode laat een kwantitatieve analyse van cAMP-geïnduceerde herverdeling van belangrijke signalering componenten in het verloop sensing machines. Gemeten spatiotemporele dynamiek van deze signaleringscomponenten ons in staat stellen te begrijpen hoe het signaleringsnetwerk aanpassing bereikt om een uniforme prikkels, terwijl het genereren van gepolariseerd biochemische reacties op hellingen (Fig. 3B).
- Systemische metingen van de kinetiek van chemosensing signaleringsnetwerk bij blootstelling aan een constante helling. Het is van cruciaal belang voor de dynamiek / kinetiek meten van directionele-sensing signaleringscomponenten om te begrijpen hoe elk onderdeel bijdraagt aan de totstandkoming van intracellulaire polarisatie wanneer de cellen ervaren eerste gradiënt. Toepassing van live cell imaging met een hoge tempo-ruimtelijke resolutie, hebben we eerst tonen een bifasisch PIP 3 productie van de cel die is blootgesteld aan een constante cAMP gradiënt (Fig. 4A-C). Het toepassen van live-cell imaging, hebben we systematisch gemeten dynamiek van directionele-sensing specifieke signalering netwerk van cAMP stimuleren tot de productie PIP 3 (fig. 4D, E).
- Gelijktijdige monitoring heterotrimere G-eiwit activering en PIP 3 productie op uniforme wijze worden toegepast cAMP stimulatie. Förster resonance energy transfer (FRET afgekort) biedt een efficiënte aanpak van heterotrimere G-eiwit activering (dissociatie) monitor bij de cAMP stimulatie. Hier beschreven we een handige easy-vast te stellen voor een gelijktijdige meting van heterotrimere G-eiwit activering en PIP 3 productie door het toezicht op de FRET verandering en membraan translocatie van PIP 3 sonde, PH-GFP in G en de PH-cellen, respectievelijk (Fig. 5 ). Een uniforme wijze wordt toegepast cAMP stimulatie veroorzaakt een aanhoudende G-eiwit activering, terwijl die leidt tot een voorbijgaande PIP 3 productie.
Figuur 1: Een uitstekend modelsysteem van D. discoideum voor GPCR gemedieerde chemotaxis. A. Schema toont een korte signaalweg van directionele sensing. B. cAMP gradient induceert een snelle chemotaxis van D. discoideum cellen. Cellen brengen PIP 3 sonde, PH-GFP (groen). Gradiënt (rood) wordt gevisualiseerd door Alexa 594. Schaalbalk = 50μm.
Figuur 2: chemotaxis van cellen onder een zichtbaar en manipuleerbaar chemoattract velden. A. grafiek toont een lineair verband tussen cAMP concentratie en de intensiteit van een fluorescente kleurstof Alexa 594 door een verdunningsreeks van 2 uM cAMP gemengd met 10 ug / mL Alexa 594. B. Kwantitatieve meting van cAMP concentratie van een gradiënt door de lineaire relatie van cAMP concentratie en de intensiteit van de fluorescente kleurstof Alexa 594 in A.
Figuur 3: Cell motiliteit is ontkoppeld met cel polarisatie en directionele sensing. A. Image blijkt dat onbeweeglijk cellen door de behandeling van actine polymerisatieremmer Latrunculin B behouden de mogelijkheid van directionele sensing. Cellen brengen PIP 3 sonde, PH-GFP (groen). Gradiënt (rood) wordt gevisualiseerd door Alexa 594. B. manipuleerbaar cAMP stimuleren en onbeweeglijk cel systeem maakt het mogelijk aan te pakken belangrijke vragen van directionele sensing. Schaalbalk = 10μm.
Figuur 4: Systemische metingen van de kinetiek van chemosensing signaleringsnetwerk bij blootstelling aan een constante gradiënt. A. Montage vertoont een bifasische PIP 3 productie (groen) van de cel die is blootgesteld aan een constante cAMP gradiënt (rood). B. Image geeft de regio's van de belangen (ROI) voor het meten van de kinetiek van PIP 3 de productie die in C. C . Kinetics of PIP 3 productie in de cellen blootgesteld aan een constante helling. D. schema toont het signaleringsnetwerk van directionele sensing van cAMP stimulatie om PIP 3 productie. Hun kinetiek bij blootstelling aan een constante gradiënt wordt gepresenteerd in dezelfde kleur vaste lijnen in E.
Figuur 5: Gelijktijdige bewaking multi-gebeurtenissen van GPCR signalering netwerken. A. Schema toont gelijktijdige meting van heterotrimere G-eiwit activering en PIP 3 productie door het toezicht op de FRET verandering en membraan translocatie van PIP 3 sonde, PH-GFP in G en de PH-cellen, respectievelijk. B. Montage van de regenboog beelden van G-en PH-cellen shows dat een uniforme wijze wordt toegepast cAMP stimulatie veroorzaakt een aanhoudende G-eiwit geactiveerd op de mobiele randapparatuur, terwijl die jongeren een tijdelijke PIP 3 productie. De tijdstippen zijn voor (0s) en na stimulatie voor 4.9s, 10.2s en 20.4s. C. Kinetiek van de G-eiwit activering en PIP 3 de productie op een uniforme wijze worden toegepast cAMP stimulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De processen van het bereiken van chemotactische bevoegde stadium van de cellen
Voor wild-type D. discoideum cellen, het duurt ongeveer 5 ~ 6 uur pulserende ontwikkeling bij kamertemperatuur om ze te bewegen tot een goed chemotactische bevoegde fase waarin cellen weer een goed gepolariseerd cellulaire morfologie en de snelle celmigratie (afb. 1). Verschillende factoren, zoals de cAMP concentratie voor pulserende, temperatuur, en verschillende genetische achtergronden, van invloed kunnen zijn het proces van het bereiken van chemotactische bevoegde podium. Een cAMP gradiënt leidt de cellen te bewegen in de richting van de bron van cAMP, een gerichte celmigratie aangewezen als chemotaxis. Kan echter cellen die niet hebben bereikt de chemotactische bevoegde stadium als gevolg van onvoldoende ontwikkeling of hun genetische achtergrond niet tonen twee typische kenmerken: gepolariseerde morfologie en snelle cel beweging. Aan de andere kant, cellen die de chemotactische bevoegde stadium zijn gepasseerd door de over-ontwikkeling vaak klonten vorm van de cellen, die zeer moeilijk om in individuele cellen apart voor imaging experimenten ..
1. Imaging chemotaxing cellen in een zichtbaar en manipuleerbaar chemoattractant gradiënt
Het is een technische vooruitgang te fluorescent gelabelde en manipuleerbaar chemoaantrekkende stimulatie toe te passen in een experimenteel systeem. Historisch gezien, hadden we aangevraagd of homogeen toegepaste stimulatie (ook wel uniform stimulatie) of helling stimulatie naar cel morfologie en gedrag te observeren. Echter, een "blind" stimulatie geen tempo-ruimtelijke informatie over hoe de stimuli bereikt cellen wijst derhalve werpt twijfels op een 'abnormale' waarnemingen van cel responsen. Hier tonen we een toepassing van fluorescerende kleurstof (Alexa594, Molecular Probe) met chemoattractant om een lineair verband tussen de concentratie van chemoattractant en intensiteit van de gecontroleerde TL-dag en (Fig. 2A, B) vast te stellen. Een overname combinatie van een groen fluorescerend eiwit (GFP) en een rode uitstoot van fluorescerende kleurstof (Alexa594), die ons in staat stelt te controleren zowel een stimulatie en cel responsen op deze stimulatie (Fig. 2C).
Volgens de experimentele eisen, zijn er meer combinaties beschikbaar. Tijdens de behandeling van een nieuwe fluorescerende kleurstof, het cruciaal is om te bevestigen dat de fluorescerende geschikt is voor uw experiment, zeker voor een gradiënt experiment, is het belangrijk om te bevestigen de verspreiding co-efficiëntie van uw stimuli en fluorescerende kleurstof. Ook met het oog op het verkrijgen van een lineaire relatie van prikkels concentratie en de intensiteit van de gemengde fluorescerende kleurstof, is het noodzakelijk om de maximale concentratie van stimuli verwerven zonder verzadiging van de intensiteit.
2. Immobiele ongepolariseerde cel systeem vergemakkelijkt live cell imaging
Chemotaxis is een ingewikkeld cellulair proces, maar het kan worden ontleed in drie fundamentele aspecten: cellulaire polarisatie, beweeglijkheid en de directionele sensing. Morfologisch, is de polarisatie van de een verwezen naar een duidelijk omschreven toonaangevende front-en achterste einde van een cel. Veel signaleringscomponenten die betrokken zijn bij chemotaxis lokaliseren in ofwel de Fornt of de rug in een gepolariseerde cellen. Directionele sensing is het vermogen van een cel om een extracellulaire gradiënt in een gepolariseerd intracellulaire biochemische polarisatie vertalen. Zoals getoond in Fig. 3A, de behandeling van cellen met actine polymerisatie remmer (Latrunculin B) elimineert snel celbeweeglijkheid en de oorspronkelijke polarisatie. Opvallend is dat cellen zijn nog steeds in staat om een intracellulaire polarisatie, zoals een ophoping van PIP 3 aan de voorkant van de cellen naar de gradiënt (afgebeeld als een halve maan door PIP3biosensor, PH-GFP) tot stand, wat aangeeft dat directionele detectie van de cellen kunnen worden losgekoppeld van cel-cel polarisatie en beweeglijkheid. Deze niet-gepolariseerde cel-systeem stelt ons in staat het bepalen van de kinetiek van signalering die essentieel zijn voor chemosensing zonder de complicatie van celbeweeglijkheid en eerdere polarisatie. Pro en contra, de behandeling van actine polymerisatieremmer schaft alle dynamiek die ten laste van actine-cytoskelet.
3. Monitoring signaleringsnetwerk door multi-spectrale live cell imaging
Betrokkenheid van cAMP aan de receptor leidt tot de activering van heterotrimere G-eiwit. Als vervolgens Gβγ subeenheid distantieert van Gα subunit en activeert downstream effectoren te induceren cel responsen, zoals PIP 3 productie. Technische ontwikkelingen op de tempo-ruimtelijke resolutie van fluorescentie microscopie mogelijk een gelijktijdige beeldvorming van meerdere signalering evenementen op subcellulaire niveau in levende cellen. In deze sectie hebben we eerst laten zien een simultane beeldvorming van twee signaalmoleculen samen met het toezicht op cAMP gradiënt (Fig. 4A). Vervolgens presenteren we spectrale beeldvorming van G activering en de downstream-cel respons van de PIP 3 productie (Fig. 4B). Försterresonance energy transfer (afgekort FRET), ook bekend als fluorescentie resonantie energie-overdracht, resonantie energie-overdracht (RET) of elektronische energie-overdracht (EET), is een mechanisme beschrijft energie-overdracht tussen twee chromoforen. Er zijn drie criteria voor het optreden van de FRET: overlap van donor en acceptor emissie-excitatie, juiste oriëntatie, en op korte afstand (<10 nm). De afstand / oriëntatie eis van twee moleculen vergemakkelijkt FRET om een efficiënte manier om eiwit-eiwit interacties of intromolecular conformatie verandering van een eiwit te detecteren zijn. Hier gebruikten we de meest gebruikte GVB / YFP FRET paar (Gα-CFP/Gβ-YFP) om de dynamische dissociatie van G-eiwit α / βγ subeenheden in levende cellen te volgen. Als een slimme opzet van het experiment hebben we hier beschreven is om twee verschillende soorten cellen mix om tegelijkertijd het monitoren van zowel G-eiwit activering en PIP 3 de productie als het niet handig om alle dynamiek te meten in een cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de intramurale fonds uit NIAID, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma-Aldrich | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| cAMP | Sigma-Aldrich | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc international | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Carl Zeiss, Inc. | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus Corporation | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
References
- Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
- Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
- Devreotes, P. N. G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium. Neuron. 12, 235-235 (1994).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-1 (2008).
- Meier-Schellersheim, M. Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method. PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).
- Xu, X. Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Sci Signal. 3, 71-71 (2010).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing. J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).
- Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis. Science. 287, 1034-1034 (2000).
- Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2408 (2001).
- Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium. J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).
- Li, Z. Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287, 1046-1046 (2000).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).
- Meili, R. Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium. EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.
- Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells. Cell. 95, 81-81 (1998).
- Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis. Cell. 109, 611-611 (2002).
- Iijima, M., Devreotes, P. Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients. Cell. 109, 599-599 (2002).
- Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N.
