Summary
Här beskriver vi detaljerat leva metoder cell imaging för att undersöka chemotaxis. Vi presenterar fluorescens mikroskopiska metoder för att övervaka Spatiotemporal dynamik signalering händelser i vandrande celler. Mätning av signalering händelser som tillåter oss att ytterligare förstå hur en GPCR-signalnätet uppnår lutning avkänning av chemoattractants och kontroller riktad migration av eukaryota celler.
Abstract
Många eukaryota celler kan upptäcka gradienter av kemiska signaler i sina miljöer och migrera detta 1. Denna guidade cell migration som avses kemotaxi, vilket är viktigt för olika celler att utföra sina funktioner såsom handel med immunceller och mönstring av neuronala celler 2, 3. En stor familj av G-proteinkopplade receptorer (GPCRs) känner variabel små peptider, som kallas kemokiner, direkt cell migration in vivo 4. Det slutliga målet för kemotaxi forskning är att förstå hur en GPCR maskiner sinnen kemokinreceptorantagonist lutningar och kontroller signalering händelser som ledde till chemotaxis. För detta ändamål använder vi avbildningstekniker för att övervaka i realtid, Spatiotemporal koncentrationer av chemoattractants, cellens rörelse i en lutning på chemoattractant, medierad GPCR aktivering av heterotrimeric G-protein, och intracellulär signalering skeenden inblandade i chemotaxis av eukaryota celler 5-8 . Den enkla eukaryot organism, Dictyostelium discoideum visar chemotaxic beteenden som liknar dem av leukocyter, och D. discoideum är ett viktigt modellsystem för att studera eukaryota chemotaxis. Som fritt levande amöbor, D. discoideum celler delar sig i rika medium. Vid svält, celler ange ett utvecklings-program där de sammanlagda via cAMP-medierad chemotaxis att bilda multicullular strukturer. Många komponenter som chemotaxis till lägret har identifierats i D. discoideum. Bindningen av cAMP till en GPCR (car1) inducerar dissociation av heterotrimeric G-proteiner i Gγ och subenheter Gβγ 7, 9, 10. Gβγ subenheter aktivera Ras, som i sin tur aktiverar PI3K, konvertering PIP 2 till PIP 3 på cellmembranet 11-13. PIP-3 fungerar som bindningsställen för proteiner med pleckstrin homologi (PH) domäner, vilket rekrytera dessa proteiner till membran 14, 15. Aktivering av car1 receptorer styr också membranet sammanslutningar av PTEN som dephosphorylates PIP 3 till PIP-2 16, 17. De molekylära mekanismerna är evolutionärt bevarade i kemokinreceptorantagonist GPCR-medierad chemotaxis av mänskliga celler, såsom neutrofiler 18. Vi presenterar följande metoder för att studera chemotaxis av D. discoideum celler. 1. Beredning av kemotaxi komponent celler. 2. Imaging chemotaxis av celler i ett läger lutning. 3. Övervakning en GPCR inducerad aktivering av heterotrimeric G-protein i enstaka levande celler. 4. Imaging chemoattractant-styrd dynamisk PIP 3 svar i enskilda levande celler i realtid. Vår utvecklade imaging metoder kan tillämpas för att studera chemotaxis av humana leukocyter.
Protocol
1. Beredning av kemotaxi behöriga celler Dictyostelium discoideum
- För att generera D. discoideum celler som kemotaxi till chemoattractant cAMP, skörd celler växer i D3-T-rik media från en skakning kultur vid 22 ° C.
- Tvätta cellerna två gånger i icke-näringsämnen utvecklings-buffert (DB buffert innehållande 5 mM Na 2 HPO 4, 5 mm KH 2 PO 4, 2 mm MgCl 2 och 0,1 mM CaCl 2).
- Återsuspendera cellerna i BF buffert vid en densitet av 2x10 7 celler / ml.
- Skaka 10 ml celler i en 250 ml kolv vid 100 rpm vid 22 ° C i en timme.
- Leverera 100 ìl 7,5 mikroM cAMP lager till 10 ml cellerna var sjätte minut över 6 timmar för att uppnå en slutlig koncentration på 75 Nm läger, en process som betecknas som cAMP pulserande behandling. Efter 5-6 timmar av cAMP pulserande behandling, D. discoideum celler blir kemotaxi behöriga mot cAMP lutning.
- Samla cellerna genom centrifugering vid 200 gi 5 min och sedan resuspendera cellerna med DB buffert innehållande 2,5 mM koffein, och skaka vid 200 rpm vid 22 ° C i 20 min till basolate cell till en kemotaxi situation.
2. Imaging chemotaxing celler i en synlig och manipulatable chemoattractant lutning
- Återfyllnad en mikropipett med en nygjord 30 l lösning av 1 mikroM cAMP och Alexa 594 vid 0.1μg/μl i DB buffert.
- Fäst Femtotip till en mikropipett hållare och anslut slangen till ett tryck leverera apparater, Eppendorf FemtoJet system.
- Fäst mikropipett församlingen att en mikromanipulator (Eppendorf TransferMan NK2) motoriserade mikromanipulator att ge ett stadigt tryck för att skapa en stabil lutning.
- Montera en en-bra LabTek kammare fylld med 6 ml DB buffert över en 40X olja objektiv på en konfokalmikroskop och använda ljusa fält optik, centrera Femtotip in i synfältet.
- Slå på trycket utbudet och som ersättning tryck (PC) för 70 hPa att skapa en gradient av lägret / Alexa 594 blandning.
- Visualisera cAMP lutning genom att övervaka blandning av önskade koncentrationen av cAMP och Alexa 594 fluorescens med hjälp av excitation med en 543 nm laser linje.
- Använd automatisk positionering funktion mikromanipulator att sätta mikropipett till önskad position och ställa dem som Läge 1, Läge 2 och Position 3 att manipulera den lutning som cellen utsätts för.
3. Orörlig nonpolarized cell Systemet underlättar bildbehandling signalering skeenden inblandade i cAMP lutning avkänning
- Efter koffein behandling, ta bort en delmängd av celler och centrifugera vid 500g i 3 min.
- Ta bort bufferten och späd celler till 5x10 5 celler / ml med färska DB buffert innehållande 2,5 mM koffein.
- Applicera 1 ml cellsuspension till en enda väl kammare eller 0,4 ml i varje brunn på en fyra brunnar kammare.
- Låt celler att hålla sig i 10 min, försiktigt pipettera från bufferten för att ta bort lös celler och ersätta med samma volym.
- Leta reda på önskad cellerna under mikroskop och börja avbildning.
- För ett experiment för att kontrollera dynamik signalering komponenter i cellerna utsätta en stadig lutning, behandla cellerna med 5,0 mikroM (slutlig koncentration) Latrunculin B för 10 min före experiment.
4. Samtidig övervakning heterotrimeric G-proteinet aktiveras och PIP 3 produktion
- cAMP pulserande utveckla celler samarbetet uttrycker GαCFP och YFPGβ (G celler) och celler som uttrycker PIP 3 indikator PH-GFP (PH celler) 7.
- Blanda dessa två typer av celler med förhållande 1:1 och platta dem i en-bra eller 4-väl kammare.
- Skapa och spara utsläpp fingeravtryck referenskurvan gemensamma fiskeripolitiken YFP och GFP med Lambda-läge Stack Förvärv inom spektralområdet 464 till 624 nm med en 10 nm bredd.
- Samtidigt bild G-proteinet aktiveras i G celler och PIP 3 produktion i PH celler använder med samma Lambda Stack Förvärv läget inom spektralområdet 464 till 544 nm med en 10 nm steg.
- Applicera Linjär Unmixing funktion Zeiss 510META programvara med sparade CFPand YFP och utsläpp fingeravtryck att matematiskt beräkna bidraget från varje fluoroforen i Lambda Stapla att separera den gemensamma fiskeripolitiken och YFP intensitet i enskilda kanaler i G.
- Med samma strategi, applicera Linjär Unmixing funktion med hjälp av sparade GFP och bakgrund fingeravtryck utsläpp till matematiskt beräkna GFP intensitet i PH celler.
5. Representativa resultat:
- Ett utmärkt modellsystem för D. discoideum för GPCR medierade chemotaxis. En social amöba, D. discoideum uppvisar en slående chemotaxis under livscykeln. På grund av sin genetiska och biokemiska fördelar, ger D. d en kraftfull ssystemprogram för att studera chemotaxis.
- Chemotaxis av celler i en synlig och manipulatable chemoattract fält. Här visar vi först en enkel metod för att erhålla ett linjärt samband mellan cAMP-koncentrationen och intensiteten i en fluorescerande färg Alexa 594 genom en utspädning serie 2 mikroM cAMP blandat med 10 mikrogram / ml Alexa 594 (Fig. 2A). Därefter ger vi ett enkelt sätt att visualisera lutning dessutom att fastställa en kvantitativ mätning av cAMP koncentrationen av en gradient av intensiteten i Alexa 594 (Fig. Fig.. 2B).
- Cell motilitet inte är ansluten med cell polarisering och riktad avkänning. En aktin polymerisation hämmare eliminerar befintliga morfologiska polaritet och förhindrar cellen rörelse samtidigt som cellernas förmåga riktad avkänning (Fig. 3A). Anställning av synliga och manipulatable cAMP stimulans garanterar ingång, till exempel tillämpas enhetligt stimuli eller en gradient. Denna metod ger en kvantitativ analys av cAMP-inducerad omfördelning av viktiga signalsystem komponenter i övertoningen avkänning maskiner. Mätt Spatiotemporal dynamiken i dessa signalsystem komponenter tillåter oss att förstå hur signalnätet uppnår anpassning till enhetliga stimuli samtidigt som de skapar polariserade biokemiska reaktioner på lutningar (Fig. 3B).
- Systemisk mätningar av kinetik chemosensing signalnätet efter exponering för en jämn lutning. Det är viktigt att mäta dynamiken / kinetik riktad avkänning signalering komponenter för att förstå hur varje komponent bidrar till inrättandet av intracellulära polarisering när celler uppleva första gradienten. Tillämpning av levande cell imaging med ett högt tempo-spatial upplösning visar vi först en bifasisk PIP3 produktion av cell som är utsatt för en stadig cAMP gradient (Fig. 4A-C). Tillämpa levande cell imaging, har vi mätt systematiskt dynamik riktad avkänning specifika signalnätet från lägret stimulans för att PIP3 produktionen (figur 4D, E).
- Samtidig övervakning heterotrimeric G-proteinet aktiveras och PIP 3 produktionen på ett enhetligt sätt cAMP-stimulering. Förster resonans energy transfer (förkortat FRET) utgör ett effektivt tillvägagångssätt för att övervaka heterotrimeric G-proteinet aktiveras (dissociation) vid cAMP stimulering. Här beskrev vi en bekväm lätt anta system för en samtidig mätning av heterotrimeric G-proteinet aktiveras och PIP 3 produktionen genom att övervaka FRET förändring och membran förflyttning av PIP 3 sond, PH-GFP i G och celler PH, respektive (bild 5 ). Ett enhetligt cAMP stimulering utlöser en ihållande G-proteinet aktiveras samtidigt som utlöser en övergående PIP 3 produktion.
Figur 1: Ett utmärkt modellsystem för D. discoideum för GPCR medierad chemotaxis. A. Systemet visar en kort signalväg för riktad avkänning. B. cAMP lutning inducerar snabb chemotaxis av D. discoideum celler. Celler uttrycka PIP 3 probe, pH-GFP (Green). Gradient (röd) visualiseras av Alexa 594. Skala bar = 50μm.
Figur 2: chemotaxis av celler i en synlig och manipulatable chemoattract fält. A. Diagrammet visar ett linjärt samband mellan cAMP-koncentrationen och intensiteten i en fluorescerande färg Alexa 594 genom en utspädning serie 2 mikroM cAMP blandat med 10 mikrogram / ml Alexa 594. B. kvantitativ mätning av cAMP koncentrationen av en gradient av linjärt förhållande av cAMP koncentration och intensitet fluorescerande färg Alexa 594 i A.
Figur 3: Cell motilitet inte är ansluten med cell polarisering och riktad avkänning. A. Bilden visar att orörliga celler genom behandling av aktin polymerisation hämmare Latrunculin B upprätthålla förmåga riktade avkänning. Celler uttrycka PIP 3 probe, pH-GFP (Green). Gradient (röd) visualiseras av Alexa 594. B. Manipulatable cAMP stimulering och orörlig cellsystem gör det möjligt att ta itu med viktiga frågor om riktad avkänning. Skala bar = 10μm.
Figur 4: Systemisk mätningar av kinetik chemosensing signalnätet efter exponering för en jämn lutning. A. Montage visar en bifasisk PIP 3 produktion (Grön) av cell som är utsatt för en stadig cAMP lutning (röd). B. Bilden visar regionerna intressen (ROI) för mätning av kinetik PIP 3 produktion presenteras i C. C . Kinetics of PIP 3 i cellerna utsätts för en jämn lutning. D. Systemet visar signalering nätverk av riktad avkänning från lägret stimulans till PIP 3 produktion. Deras kinetik efter exponering för en stadig lutning presenteras i samma färg heldragna linjer i E.
Figur 5: samtidig övervakning med flera händelser av GPCR signalering nätverk. A. Systemet visar samtidig mätning av heterotrimeric G-proteinet aktiveras och PIP 3 produktionen genom att övervaka FRET förändring och membran förflyttning av PIP3 sond, PH-GFP i G och celler PH, respektive. B. Montage av regnbåge bilder av G och celler PH visar att ett enhetligt cAMP stimulering utlöser en ihållande G-proteinet aktiveras på cell perifera, medan som utlöser en övergående PIP3 produktion. Tiden poäng före (0: or) och efter stimulering för 4.9s, 10.2s och 20.4s. C. Kinetiken för G-proteinet aktiveras och PIP3 produktionen på ett enhetligt sätt cAMP stimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Processerna för att nå kemotaxi behöriga skede av celler
För vilda typ D. discoideum celler, det tar ca 5 ~ 6 timmar pulserande utveckling i rumstemperatur för att förmå dem till en väl kemotaxi behöriga etapp under vilken celler som visar ett väl polariserad cellulär morfologi och snabb cell migration (Fig. 1). Flera faktorer, såsom cAMP-koncentrationen för pulserande, temperatur och olika genetiska bakgrunder, kan påverka processen att nå kemotaxi behöriga skede. Ett läger lutning styr cellerna att röra sig mot källan av cAMP, en riktad cell migration betecknas som chemotaxis. Däremot kan celler som inte har nått kemotaxi behöriga skede på grund av otillräcklig utveckling eller deras genetiska bakgrund visar inte två typiska egenskaper: polariserad morfologi och snabb cell rörelse. Å andra sidan, celler som har passerat kemotaxi behöriga skede på grund av över-utveckling utgör ofta klumpar av celler, som är mycket svåra att dela upp i enskilda celler för avbildning experiment ..
1. Imaging chemotaxing celler i en synlig och manipulatable chemoattractant lutning
Det är ett tekniskt framsteg för att tillämpa fluorescerande och manipulatable chemoattractant stimulering i ett experimentellt system. Historiskt hade vi appliceras antingen homogent tillämpas stimulering (även kallad enhetlig stimulering) eller övertoning stimulering för att observera cellmorfologin och beteenden. Visar dock en "blind" stimulans ingen tempo-spatial information om hur de stimuli som når cellerna, därför kastar tvivel på någon "onormal" observationer av cellens svar. Här visar vi en tillämpning av fluorescerande färg (Alexa594, molekylär Probe) med chemoattractant att etablera ett linjärt samband mellan halten av chemoattractant och intensitet övervakas fluorescerande dag (Fig. 2A, B). Ett förvärv kombination av grönt fluorescerande protein (GFP) och en röd utsläpp av fluorescerande färg (Alexa594) som tillåter oss att övervaka både en stimulering och svar cell på denna stimulering (Fig. 2C).
Enligt den experimentella kravet, det finns fler kombinationer tillgängliga. När man överväger en ny fluorescerande färg, är det viktigt att bekräfta den fluorescerande är lämplig för ditt experiment, särskilt för en lutning experiment är det viktigt att bekräfta spridningen samarbete effektiviteten i din stimuli och fluorescerande färg. Dessutom, för att få ett linjärt samband av stimuli koncentration och intensitet av den blandade fluorescerande färg, är det nödvändigt att skaffa sig den högsta koncentration av stimuli utan mättnad av intensitet.
2. Orörlig nonpolarized cell Systemet underlättar levande cell imaging
Chemotaxis är en komplicerad cellulär process, men det kan dissekeras in i tre grundläggande aspekter: cellulära polarisation, motilitet och riktad avkänning. Morfologiskt är polarisering av en enligt ett tydligt definierat ledande främre och bakre änden av en cell. Många signalering komponenter som chemotaxis lokalisera antingen i fornt eller tillbaka i ett polariserat celler. Riktad avkänning är möjligheten av en cell för att översätta en extracellulär gradient i en polariserad intracellulära biokemiska polarisering. Som visas i figur. 3A, eliminerar behandling av cellerna med aktin polymerisation hämmare (Latrunculin B) snabbt cell motilitet och dess ursprungliga polarisering. Påfallande, celler fortfarande kunna upprätta en intracellulär polarisering, som en ansamling av PIP 3 på framsidan av cellerna mot gradienten (visas som en halvmåne av PIP3biosensor, PH-GFP), vilket indikerar att riktad avkänning av cellerna kan frikopplas från cell polariseringen och cell motilitet. Denna icke-polariserade celler gör att vi kan bestämma kinetiken av signalering komponenter som är nödvändiga för chemosensing utan komplikation av cell motilitet och tidigare polarisering. Pro och con, avskaffar behandling av aktin polymerisation hämmare allt den dynamik som anhöriga på aktin-cytoskelettet.
3. Övervakning signalering nätverk genom multispektralt levande cell imaging
Engagemang av cAMP till dess receptor utlöser aktivering av heterotrimeric G-protein. Som ett senare Gβγ subenhet dissocierar från Gα subenhet och aktiverar nedströms effektenheter att inducera cell svar som PIP3 produktion. Tekniska framsteg på tempo-spatial upplösning av fluorescerande mikroskopi tillåter en samtidig avbildning av flera signalering händelser på subcellulära nivå i levande celler. I detta avsnitt visar vi först en samtidig avbildning av två signalmolekyler samt övervakning cAMP gradient (Fig. 4A). Därefter presenterar vi spektral avbildning av G aktivering och nedströms cell svar PIP3 produktionen (Fig. 4B). Försterresonans energy transfer (förkortat FRET), även känd som fluorescens resonans energi överföring, resonans energi överföring (RET) eller elektronisk energiöverföring (EET), är en mekanism som beskriver energiöverföring mellan två kromoforer. Det finns tre kriterier för uppkomst av FRET: överlappning av givare utsläpp och acceptor excitation, lämplig orientering och korta avstånd (<10 nm). Avståndet / orientering kravet på två molekyler underlättar FRET sig vara ett effektivt sätt att upptäcka protein-protein interaktion eller intromolecular konformation förändring av ett protein. Här har vi använt den gemensamma fiskeripolitiken används / YFP FRET par (Gα-CFP/Gβ-YFP) att övervaka den dynamiska dissociation av G-protein α / βγ subenheter i levande celler. Som en smart experimentell design vi beskrivit här är att blanda två olika typer av celler för att samtidigt övervaka både G-proteinet aktiveras och PIP3 produktionen när det inte är bekvämt att mäta alla dynamik i en cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av intramural fonden NIAID, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma-Aldrich | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| cAMP | Sigma-Aldrich | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc international | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Carl Zeiss, Inc. | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus Corporation | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
References
- Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
- Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
- Devreotes, P. N. G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium. Neuron. 12, 235-235 (1994).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-1 (2008).
- Meier-Schellersheim, M. Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method. PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).
- Xu, X. Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Sci Signal. 3, 71-71 (2010).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing. J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).
- Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis. Science. 287, 1034-1034 (2000).
- Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2408 (2001).
- Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium. J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).
- Li, Z. Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287, 1046-1046 (2000).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).
- Meili, R. Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium. EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.
- Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells. Cell. 95, 81-81 (1998).
- Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis. Cell. 109, 611-611 (2002).
- Iijima, M., Devreotes, P. Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients. Cell. 109, 599-599 (2002).
- Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).
