Summary
在这里，我们描述了详细的调查趋化活细胞成像的方法。我们目前的荧光显微方法来监测细胞迁移的信号事件的时空动态。测量信号的事件，使我们进一步了解如何GPCR的信令网实现了梯度感应的趋化因子和控制真核细胞的定向迁移。
Abstract
许多真核细胞中可以检测到在其环境中的化学信号的梯度迁移相应的 1 。这种引导细胞迁移被称为趋化作用，这是必不可少的各种细胞进行他们的功能，如免疫细胞和神经细胞2，3的图案贩运。一个大家族的G蛋白偶联受体（GPCRs的）检测变量，作为趋化因子的小分子肽， 直接在 体内 4细胞的迁移。趋化研究的最终目的是要了解一个GPCR的机械感官的趋化因子梯度和控制信号的事件，以趋化。为此，我们使用成像技术，实时监测，时空趋化因子，细胞运动的趋化因子梯度浓度，G蛋白偶联受体介导的异三聚体G蛋白的激活，细胞内的信号在 5-8真核细胞趋化涉及事件。简单的真核有机体，粘菌，显示chemotaxic行为类似白细胞和 D discoideum是一个重要的模型系统，为研究真核细胞趋化。由于自由生活的阿米巴，D discoideum细胞分裂丰富培养基。饥饿时，细胞进入一个发展的计划中，他们通过cAMP介导的趋化聚集，形成multicullular结构。趋化阵营中涉及的许多组件已经确定在 D discoideum。阵营的一个G蛋白偶联受体的结合（cAR1）诱导的异三聚体G蛋白解离成Gγ和Gβγ 亚基7，9，10 。 Gβγ亚基激活Ras，这反过来又激活的PI3K，转换成11-13细胞膜上的画中画画中画3 2。作为画中画3 pleckstrin同源性（PH值）域的蛋白质结合位点，从而招募这些蛋白膜14，15 。 cAR1受体的激活还控制PTEN基因， 这 3画中画画中画2月 16日，17去磷酸化膜 协会。是进化上保守的G蛋白偶联受体介导的趋化因子，如中性粒细胞18的人体细胞趋化的分子机制。我们提出了下面的方法研究D 的趋化discoideum细胞 。 1。制备趋化组件细胞。 2。成像的细胞趋化的一个营地梯度。 3。监测的异三聚体G蛋白G蛋白偶联受体在单个活细胞中的诱导活化。 4。在单个活细胞实时成像趋化触发动态画中画3反应。我们开发的成像方法可以应用于研究人类白细胞趋化作用。
Protocol
1。 粘菌的趋化主管细胞的制备
- 要生成四discoideum细胞趋化的趋化营，收获细胞增长，从一个惊天文化D3 - T的富媒体在22 ° C。
- 非营养发育缓冲区清洗细胞两次（DB缓冲区含5毫米的Na 2 HPO 4，5毫米的KH 2 PO 4，MgCl 2的2毫米，0.1毫米氯化钙 2） 。
- 重新暂停在DB缓冲区细胞密度在2 × 10 7细胞/ ml。
- 摇在100转速在22 ° C 10毫升细胞一小时，在250毫升容量瓶中。
- 10毫升的细胞超过6小时，每6分钟提供100μL7.5μM的cAMP的股票达到了75纳米营的终浓度，cAMP的脉冲治疗指定的进程。经过5-6小时内cAMP脉冲治疗，D. discoideum细胞成为趋朝内cAMP梯度主管。
- 200克5分钟离心收集细胞，然后与数据库缓冲悬浮细胞含有咖啡因2.5毫米，摇匀，在200转，在22 ° C加热20分钟basolate细胞一个细胞趋化的形势。
2。在可见的和可操作的趋化因子梯度成像chemotaxing细胞
- 回填一个微管与新鲜配制的30μL1微米的营地和Alexa 5940.1μg/μl在DB缓冲区的解决方案。
- 的Femtotip连接到一个微管人和连接管，压力供应装置的Eppendorf FemtoJet系统。
- 将微量大会（Eppendorf公司TransferMan NK2）机动显微提供一个稳定的压力，以建立一个稳定的渐变到显微。
- 一个6毫升数据库缓冲区填充超过40X石油镜头共聚焦显微镜以及LabTek室安装和使用的视野明亮场光学中心Femtotip。
- 打开的供给压力，并设置为70百帕补偿的压力（PC），建立一个营/ Alexa的594混合的梯度。
- 可视化监测所需的营地和Alexa 594与543 nm激光线激发荧光使用浓度的混合物中cAMP梯度。
- 使用自动定位的显微操纵器的功能，把微量到所需的位置和设置位置1，位置2，位置3操纵细胞暴露梯度。
3。不动无极细胞系统方便营梯度传感信号成像涉及事件
- 咖啡因治疗后，取出在500克等分细胞和离心3分钟。
- 取出缓冲和稀释细胞以5 × 10 5细胞/毫升新鲜的DB缓冲区含2.5毫米咖啡因。
- 用1 ml的细胞悬液单以及商会或0.4毫升，每孔以及四室。
- 让细胞坚持10分钟，仔细移液器关闭缓冲区，删除独立的细胞，并取代同体积。
- 在显微镜下找到所需的细胞，并开始成像。
- 监察动态信号在细胞暴露在一个稳定的梯度组件设计一个实验，把5.0微米（终浓度）Latrunculin乙前10分钟的实验细胞。
4。同时监测异三聚体G蛋白的激活和PIP 3生产
- cAMP的脉冲培养细胞共同表达GαCFP和YFPGβ（G细胞）和细胞表达PIP 3指标的PH - GFP（PH值细胞）7。
- 在1:1的比例和板他们在一孔或4孔商会混合这两种类型的细胞。
- 创建和保存排放指纹参考曲线CFP，YFP和GFP与一个10纳米的宽度从464到624纳米的光谱范围内使用LAMBDA栈收购模式。
- 同时图像G蛋白激活G细胞和PIP 3 PH值从464至544纳米与10纳米的增量的光谱范围内使用相同的Lambda堆栈采集模式的细胞生产。
- 应用线性分解蔡司510META软件功能，使用保存CFPand YFP和排放指纹数学计算每个荧光在lambda协议栈的贡献，分离成单独的渠道在CFP和YFP的强度在G
- 同样的策略，适用于线性分解的功能，使用数学计算绿色荧光强度在PH细胞保存的GFP和背景排放指纹。
5。代表性的成果：
- D 的一个很好的模型系统G蛋白偶联受体介导的趋化作用。discoideum社会变形虫，D. discoideum展品在生命周期的一个显着的趋化。由于它的遗传和生化优势，D. D提供了一个功能强大的System研究的趋化作用。
- 细胞趋化下一个可见的和可操作chemoattract的领域 ，在这里，我们首先展示一个简单的的方法获得cAMP浓度和稀释的2微米营的10微克/毫升混合系列荧光染料Alexa的594强度之间的线性关系Alexa的594（图2A）。下一步，我们提供了一个简单的方法来可视化的梯度，此外，为了建立一个渐变的cAMP浓度的定量测量的Alexa 594（图图2b）的强度。
- 细胞运动与细胞极化和定向感应耦合。肌动蛋白聚合抑制剂消除既存的形态学极性，也可以防止细胞的运动，同时保持细胞的定向感应能力（图3A） 。可见的和可操作的 cAMP刺激就业保障的投入，例如统一适用的刺激或渐变。此方法允许梯度传感机械营诱导的关键信号元件再分配的定量分析。这些信号组件测量的时空动态，让我们了解如何信令网实现适应统一的刺激而产生极化生化反应梯度（图3B）。
- 全身性的化学传感信号后，接触到一个稳定的梯度网络的动力学测量，这是关键的衡量动力学/动力学定向感应信号组件了解每个组件如何有助于建立细胞内极化时，细胞的经验第一梯度。活细胞成像中的应用与一个高节奏的空间分辨率，我们首先显示双相PIP3生产的细胞暴露在一个稳定的营梯度（图4A - C），。采用活细胞成像，我们有系统地测量的动态定向感应cAMP刺激PIP3的生产（图4D，E），具体的信令网。
- 同步监测异三聚体G蛋白的激活和画中画3条生产后，一律适用cAMP刺激。福斯特共振能量转移（FRET的缩写）提供了一种有效的方法，监察cAMP刺激后异三聚体G蛋白的激活（分解） 。在这里，我们描述了一个异三聚体G蛋白的激活和PIP 3生产的同时测量，方便易采取系统监测FRET变化和膜画中画易位 ，分别为3探头，PH值在G和PH细胞的GFP（图5 ）。一个统一适用的cAMP刺激触发一个持久的G蛋白的激活，而这将触发一个短暂的PIP 3生产。
图1：D 的一个很好的模型系统discoideum为GPCR介导的趋化。 B. CAMP梯度诱导D.迅速趋化A.计划显示了一个简短的定向感应信号转导通路。 discoideum细胞。细胞表达画中画3探头，PH - GFP（绿色）。梯度（红色）594 Alexa的可视化。比例尺为50μm。
图2：下一个可见的和可操作chemoattract的领域的细胞趋化。 答 ：图表显示cAMP浓度和强度的荧光染料Alexa的594系列稀释的2微米与10μg/ mL的Alexa的594混合的营地之间的线性关系。营梯度浓度的定量测量的线性关系cAMP浓度和强度的荧光染料Alexa的594 A中
图3：细胞运动与细胞极化和定向感应耦合。 A.图像显示，动弹不得细胞治疗肌动蛋白聚合抑制剂Latrunculin乙保持定向检测的能力。细胞表达画中画3探头，PH - GFP（绿色）。渐变（红）594 Alexa的可视化。B.可操作的cAMP的刺激和不动的电池系统允许定向检测，以解决关键问题。比例尺=10μm的。
图4：后，接触到一个稳定的梯度化学传感信号网络系统动力学测量 。 A.蒙太奇显示双相PIP 3条生产（绿色）的细胞接触到一个稳定的营梯度（红色）。图像显示在C。C画中画3条生产动力学测量地区的利益（投资回报） 。动力学直径f画中画3生产的细胞在接触到一个稳定的梯度。D.计划显示了从cAMP刺激画中画3条生产定向检测信令网。他们在接触到一个稳定的梯度动力学是在 E在相同颜色的实线。
图5：同时监控多的G蛋白偶联受体信号网络事件。 A.计划显示监测FRET分别PIP3的探头，PH - GFP的G和PH细胞的变化和膜易位异三聚体G蛋白的激活和 PIP 3生产的同时测量B. G和PH细胞的彩虹图像蒙太奇显示。一个统一适用的cAMP刺激触发一个持久的G蛋白激活，在细胞外围，而这将触发一个短暂的PIP3的生产。时间点前（0）和刺激后4.9s，10.2s和20.4s。C. G蛋白激活后一个统一适用的cAMP刺激生产和PIP3的动力学。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
深远的趋化细胞的主管阶段进程
对于野生型D. discoideum细胞，大约需要5〜6小时脉冲在室温下的发展，诱导他们进入一个良好的趋化主管的阶段，在此期间，细胞中显示良好的极化的细胞形态和细胞快速迁移（图1）。几个因素，如cAMP的浓度为脉冲，温度和不同的遗传背景，可能会影响深远的趋化主管阶段的过程。一个营地梯度引导细胞走向cAMP的来源，细胞迁移的趋化指定。然而，还没有达到细胞趋主管阶段，由于发展不足或他们的遗传背景，可能不会显示两个典型特征：两极化的形态和细胞快速运动。另一方面，由于过度开发，已通过细胞趋主管阶段往往形成细胞的团块，这是很难分开成单个细胞成像实验的..
1。在可见的和可操作的趋化因子梯度成像chemotaxing细胞
它是技术进步的一个实验系统应用到荧光标记的和可操作的趋化因子刺激。从历史上看，我们已申请均匀施加的刺激或者（也称为统一的刺激）或梯度刺激，观察细胞的形态和行为。然而，一个“盲点”刺激没有对如何刺激达到细胞的时空信息，因此使人们对任何“不正常”的细胞反应的观察疑虑。在这里，我们显示了荧光染料的应用程序（Alexa594，分子探针）与趋化因子的趋化和监测荧光一天强度的浓度和（图2A，B）之间建立的线性关系。收购相结合的绿色荧光蛋白（GFP）和红色发光的荧光染料（Alexa594），这使我们可以监视一个刺激，这种刺激后的细胞反应（图2C）。
根据实验要求，也有更多的组合。在考虑一个新的荧光染料的，关键是要确认的荧光是适合你的实验，尤其是对梯度实验，重要的是要确认您的刺激和荧光染料的扩散合作效率。此外，为了获得一个刺激浓度和强度的混合荧光染料的线性关系，它是必要的，以获得最高浓度不饱和强度的刺激。
2。不动无极细胞系统，促进活细胞成像
趋化是一个复杂的细胞的过程;，但是，它可分为三个基本方面剖析：细胞的极化，运动和定向检测。形态上，两极分化的A是指一个明确界定的领先的前面和尾部的一个单元结束。在趋化所涉及的许多信号组件的本地化fornt或极化细胞回。定向感应是一个细胞的能力，转化成一个极化的细胞内的生化两极分化外梯度。如图所示。 3A，治疗细胞与肌动蛋白聚合抑制剂（Latrunculin二）迅速消除细胞的运动和其原来的极化。引人注目的是，细胞仍然能够建立一个细胞内的两极分化，如在前面面临的梯度（由PIP3biosensor月牙，PH - GFP）的细胞积累的画中画3，，表明细胞定向检测可耦合细胞极化和细胞运动。这种非极化的细胞系统，使我们能够确定为无细胞的运动和以前的两极分化的并发症化学传感的核心组件信号动力学。赞成和反对，肌动蛋白聚合抑制剂治疗废除所有的动态，对肌动蛋白细胞骨架的家属。
3。信令监测网络由多光谱活细胞成像
营地及其受体的参与触发的异三聚体G蛋白的激活。随后，从Gα亚基Gβγ亚基解离，并激活下游效应，诱导细胞反应，如PIP3的生产。技术进步的时空分辨率荧光显微镜允许同时成像的几个信号在活细胞中的亚细胞水平的事件。在本节中，我们首先显示出两个信号分子，以及与监测营梯度（图4A）的同时成像。下一步，我们目前G的活化和其下游细胞反应PIP3的生产（图4B）的光谱成像。福斯特共振能量转移（简称FRET）技术，也称为荧光共振能量转移，共振能量转移（RET）的或电子的能量转移（EET），是描述两个生色团之间的能量转移的机制。有三个标准发生FRET技术：重叠排放和受捐助者的激励，正确的方向，和短距离（<10纳米）。两个分子的距离/方向的要求，方便的FRET是一个有效率的方法来检测蛋白质相互作用或intromolecular一种蛋白质构象的变化。在这里，我们用共同使用的CFP / YFP FRET（Gα-CFP/Gβ-YFP）对监测活细胞中G蛋白α/βγ亚基的动态解离。作为一个巧妙的实验设计，我们这里描述的是混合两种不同类型的细胞，同时监测两个G蛋白的激活和PIP3的生产时不方便来衡量一个单元格中的所有动态。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由国立卫生研究院从NIAID的，壁间基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma-Aldrich | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| cAMP | Sigma-Aldrich | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc international | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Carl Zeiss, Inc. | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus Corporation | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
References
- Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
- Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
- Devreotes, P. N. G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium. Neuron. 12, 235-235 (1994).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-1 (2008).
- Meier-Schellersheim, M. Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method. PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).
- Xu, X. Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Sci Signal. 3, 71-71 (2010).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).
- Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing. J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).
- Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis. Science. 287, 1034-1034 (2000).
- Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2408 (2001).
- Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium. J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).
- Li, Z. Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287, 1046-1046 (2000).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).
- Meili, R. Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium. EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.
- Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells. Cell. 95, 81-81 (1998).
- Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis. Cell. 109, 611-611 (2002).
- Iijima, M., Devreotes, P. Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients. Cell. 109, 599-599 (2002).
- Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).
