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इमेजिंग जी प्रोटीन युग्मित (GPCR) रिसेप्टर की मध्यस्थता संकेतन घटनाक्रम कि नियंत्रण chemotaxis Discoideum Dictyostelium Published: September 20, 2011 doi: 10.3791/3128
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1, 1
1Chemotaxis Signal Section, Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

Summary

यहाँ, हम विस्तृत chemotaxis जांच के लिए जीना सेल इमेजिंग तरीकों का वर्णन. हम प्रतिदीप्ति सूक्ष्म तरीके मौजूद पलायन कोशिकाओं में घटनाओं का संकेत के spatiotemporal गतिशीलता की निगरानी. संकेत घटनाओं के मापन हमें आगे समझने के लिए कैसे एक GPCR संकेतन नेटवर्क chemoattractants और नियंत्रण यूकेरियोटिक कोशिकाओं के दिशात्मक प्रवास के संवेदन ढाल प्राप्त परमिट.

Protocol

1. Dictyostelium discoideum की chemotactic सक्षम कोशिकाओं की तैयारी

  1. डी. discoideum कोशिकाओं है कि chemoattractant शिविर, फसल मिलाते संस्कृति से D3-टी अमीर मीडिया में 22 से बढ़ रहा है कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस के लिए chemotactic हैं उत्पन्न करने के लिए
  2. कोशिकाओं को दो बार गैर पोषक तत्व विकास बफर में धो (DB बफर 5 मिमी ना 2 4 HPO, 5 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 2 मिमी 2 MgCl, और 0.1 मिमी 2 CaCl युक्त).
  3. DB के बफर में 2x10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व कोशिकाओं पुनः निलंबित.
  4. एक 250 मिलीलीटर की कुप्पी में 10 मिलीलीटर की कोशिकाओं को एक घंटे के लिए 22 में 100 rpm ° सी में हिलाओ.
  5. 6 घंटे से अधिक 10 मिलीलीटर की कोशिकाओं को हर छह मिनट के लिए 75 एनएम शिविर का अंतिम एकाग्रता, एक शिविर स्पंदन उपचार के रूप में नामित प्रक्रिया को प्राप्त करने के लिए 7.5 सुक्ष्ममापी शिविर शेयर के 100 μl उद्धार करने के लिए. शिविर स्पंदन उपचार, डी. के 5-6 घंटे के बाद discoideum कोशिकाओं शिविर ढाल की ओर सक्षम chemotactic हो गया है.
  6. 5 मिनट के लिए 200 ग्राम पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं और लीजिए तो DB बफर के साथ resuspend कोशिकाओं 2.5 मिमी कैफीन युक्त, और 22 पर 200 rpm पर हिला ° 20 मिनट के लिए सी एक chemotactic स्थिति के लिए सेल basolate.

2. इमेजिंग एक दृश्य और manipulatable chemoattractant ढाल में chemotaxing कोशिकाओं

  1. Backfill हौसले से तैयार 1 सुक्ष्ममापी शिविर और एलेक्सा 0.1μg/μl पर 594 DB के बफर में 30 μl समाधान के साथ एक micropipette.
  2. एक micropipette धारक को Femtotip संलग्न और दबाव आपूर्ति तंत्र के लिए टयूबिंग, Eppendorf FemtoJet प्रणाली कनेक्ट.
  3. (Eppendorf TransferMan NK2) micromanipulator micromanipulator motorized के लिए एक स्थिर दबाव प्रदान करने के क्रम में एक स्थिर ढाल स्थापित micropipette विधानसभा संलग्न.
  4. एक अच्छी तरह से LabTek DB बफर के 6 मिलीलीटर के साथ एक 40x तेल लेंस पर एक confocal खुर्दबीन पर भरा कक्ष माउंट और देखने के क्षेत्र में उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाशिकी, केंद्र Femtotip का उपयोग करें.
  5. दबाव की आपूर्ति पर मुड़ें और 70 इंच के लिए मुआवजा दबाव (पीसी) सेट करने के लिए शिविर Alexa 594 / मिश्रण के एक ढाल की स्थापना.
  6. शिविर और एलेक्सा 594 एक 543 एनएम लेजर लाइन के साथ उत्तेजना का उपयोग कर प्रतिदीप्ति वांछित एकाग्रता के मिश्रण की निगरानी के द्वारा शिविर ढाल कल्पना.
  7. ऑटो स्थिति micromanipulator के समारोह का प्रयोग वांछित पदों के लिए micropipette डाल दिया और उन्हें 1 स्थिति, स्थिति 2, और 3 स्थिति जो सेल को उजागर कर रहे हैं ढाल हेरफेर के रूप में सेट.

3. स्थिर nonpolarized सेल प्रणाली इमेजिंग संकेत शिविर ढाल संवेदन में शामिल की घटनाओं की सुविधा

  1. कैफीन उपचार के बाद, 500g में 3 मिनट के लिए कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र के विभाज्य हटायें.
  2. बफर निकालें और 5x10 ताजा DB 2.5 मिमी कैफीन युक्त बफर के साथ 5 / कोशिकाओं मिलीलीटर कोशिकाओं पतला.
  3. एक अच्छी तरह से एक कक्ष या चार अच्छी तरह से एक कक्ष की प्रत्येक अच्छी तरह से 0.4 मिलीलीटर सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर लागू करें.
  4. कोशिकाओं के 10 मिनट के लिए, ध्यान से बंद बफर विंदुक के लिए स्वतंत्र कोशिकाओं को हटाने और एक ही मात्रा के साथ जगह पालन करने के लिए अनुमति दें.
  5. माइक्रोस्कोप के अंतर्गत वांछित कोशिकाओं का पता लगाएँ और इमेजिंग शुरू.
  6. एक प्रयोग के लिए एक स्थिर ढाल को उजागर कोशिकाओं में घटकों संकेत की गतिशीलता की निगरानी के लिए डिज़ाइन, 5.0 (अंतिम एकाग्रता) 10 प्रयोगों के लिए पहले मिनट के लिए सुक्ष्ममापी Latrunculin बी के साथ कोशिकाओं का इलाज.

4. साथ - साथ निगरानी heterotrimeric जी प्रोटीन सक्रियण और 3 उत्पादन रंज

  1. शिविर स्पंदन सह व्यक्त GαCFP और YFPGβ (जी कोशिकाओं) और कोशिकाओं 7 3 सूचक पीएच - GFP (पीएच कोशिकाओं) रंज व्यक्त कोशिकाओं का विकास
  2. 1:1 के अनुपात और उन्हें एक अच्छी तरह से या 4 अच्छी तरह कक्षों में थाली के साथ कोशिकाओं के इन दो प्रकार के मिश्रण.
  3. बनाएँ और उत्सर्जन फिंगरप्रिंट संदर्भ वक्र CFP, YFP और GFP बचाने के लिए वर्णक्रमीय सीमा के भीतर एक 10 एनएम की चौड़ाई के साथ Lambda ढेर अधिग्रहण मोड से 464 से 624 एनएम का उपयोग.
  4. इसके साथ ही जी कोशिकाओं और रंज पीएच वही Lambda ढेर अधिग्रहण मोड के साथ एक 10 एनएम वेतन वृद्धि के साथ 464 से 544 एनएम के लिए वर्णक्रमीय सीमा के भीतर का उपयोग कर कक्षों में 3 उत्पादन में छवि जी प्रोटीन सक्रियण.
  5. Zeiss 510META सॉफ्टवेयर के रैखिक unmixing समारोह बचाया CFPand YFP और उत्सर्जन उँगलियों के निशान का उपयोग करने के लिए गणितीय Lambda ढेर में प्रत्येक की fluorophore योगदान की गणना करने के लिए CFP और जी में YFP तीव्रता अलग - अलग चैनलों में अलग लागू करें
  6. उसी रणनीति के साथ, रैखिक unmixing बचाया GFP और पृष्ठभूमि उत्सर्जन उँगलियों के निशान का उपयोग करने के लिए गणितीय पीएच कोशिकाओं में GFP तीव्रता की गणना समारोह लागू होते हैं.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

  1. डी. का एक शानदार मॉडल प्रणाली GPCR मध्यस्थता chemotaxis के लिए एक सामाजिक अमीबा, डी. discoideum. discoideum जीवन चक्र के दौरान एक हड़ताली chemotaxis दर्शाती है . अपनी आनुवंशिक और जैव रासायनिक लाभ के कारण, डी. घ एक शक्तिशाली प्रदान करता हैystem chemotaxis अध्ययन करने के लिए.
  2. कोशिकाओं के एक दृश्य और manipulatable chemoattract क्षेत्रों के तहत यहां chemotaxis. हम पहले शिविर एकाग्रता और 10 μg / एमएल के साथ मिश्रित 2 सुक्ष्ममापी शिविर का एक कमजोर पड़ने श्रृंखला के द्वारा एक फ्लोरोसेंट डाई 594 Alexa की तीव्रता के बीच एक रैखिक संबंध प्राप्त करने के लिए एक सरल पद्धति शो 594 Alexa (2A छवि). अगला, हम एक आसान तरीका करने के लिए ढाल कल्पना, इसके अलावा, Alexa 594 (छवि छवि 2B.) की तीव्रता से एक ढाल के शिविर एकाग्रता की एक मात्रात्मक माप स्थापित प्रदान करते हैं.
  3. सेल ध्रुवीकरण और दिशात्मक संवेदन के साथ सेल गतिशीलता uncoupled एक actin polymerization अवरोध करनेवाला पूर्व मौजूदा morphological polarity eliminates और भी सेल आंदोलन को रोकता है जबकि दिशात्मक संवेदन 'कोशिकाओं की क्षमता (छवि 3A) को बनाए रखने. दिखाई और manipulatable शिविर उत्तेजना के रोजगार समान लागू stimulations उदाहरण या एक ढाल के लिए इनपुट, की गारंटी देता है है. इस विधि ढाल संवेदन मशीनरी में शिविर प्रेरित कुंजी संकेत घटकों के पुनर्वितरण का एक मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है. इन घटकों के संकेत मापा spatiotemporal गतिशीलता के समझने के लिए हमें कैसे संकेतन नेटवर्क वर्दी stimulations के लिए अनुकूलन प्राप्त है जबकि gradients (3B छवि) polarized जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं पैदा अनुमति देते हैं.
  4. एक स्थिर ढाल करने के लिए जोखिम पर संकेतन नेटवर्क chemosensing के कैनेटीक्स के प्रणालीगत माप. दिशात्मक संवेदन घटकों को समझने के लिए कैसे प्रत्येक घटक intracellular ध्रुवीकरण की स्थापना के लिए योगदान देता है जब कोशिकाओं को पहली ढाल अनुभव संकेत की गतिशीलता / कैनेटीक्स को मापने के लिए महत्वपूर्ण है. जीना सेल इमेजिंग के एक उच्च गति स्थानिक संकल्प के साथ आवेदन, हम पहले सेल का एक biphasic PIP3 उत्पादन जो एक स्थिर शिविर ढाल (छवि 4A-सी) के संपर्क में है दिखाते हैं. जीना सेल इमेजिंग आवेदन, हम व्यवस्थित की गतिशीलता मापा है दिशात्मक - संवेदन शिविर उत्तेजना से PIP3 उत्पादन (छवि 4D, ई) के लिए विशिष्ट संकेतन नेटवर्क.
  5. साथ - साथ निगरानी heterotrimeric जी प्रोटीन सक्रियण और समान रूप से लागू शिविर उत्तेजना पर 3 उत्पादन रंज Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (संक्षिप्त झल्लाहट). शिविर उत्तेजना पर heterotrimeric जी प्रोटीन सक्रियण (वियोजन) की निगरानी के लिए एक कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है. यहाँ, हम heterotrimeric जी प्रोटीन सक्रियण और pip 3 उत्पादन के एक युगपत माप के लिए परिवर्तन और रंज की झिल्ली स्थानान्तरण जांच, 3 जी और पीएच कोशिकाओं में पीएच GFP, क्रमशः निगरानी झल्लाहट (5 छवि एक सुविधाजनक आसान अपनाने प्रणाली का वर्णन ). एक समान लागू शिविर उत्तेजना एक लगातार जी प्रोटीन सक्रियण चलाता है, जबकि जो एक क्षणिक रंज 3 उत्पादन हो सके .

चित्रा 1
चित्रा 1: डी. का एक शानदार मॉडल प्रणाली GPCR मध्यस्थता chemotaxis के लिए discoideum. ए स्कीम दिशात्मक संवेदन का एक संक्षिप्त संकेतन मार्ग दिखाता बी शिविर ढाल डी के तेजी से chemotaxis लाती है . discoideum कोशिकाओं. कक्ष रंज 3 जांच, पीएच GFP (ग्रीन) व्यक्त करते हैं. ग्रैडिएंट (लाल) Alexa 594 के द्वारा कल्पना है. स्केल बार = 50μm.

चित्रा 2
चित्रा 2: एक दृश्य और manipulatable chemoattract क्षेत्रों के तहत कोशिकाओं के chemotaxis . ए ग्राफ़ शिविर एकाग्रता और 2 सुक्ष्ममापी 10 μg / एमएल 594 Alexa के साथ मिश्रित शिविर के कमजोर पड़ने श्रृंखला के द्वारा एक फ्लोरोसेंट डाई 594 Alexa की तीव्रता के बीच एक रैखिक संबंध बी रैखिक संबंध के द्वारा एक ढाल की एकाग्रता शिविर के मात्रात्मक माप से पता चलता है. शिविर और ए में फ्लोरोसेंट डाई 594 Alexa की एकाग्रता की तीव्रता

चित्रा 3
चित्रा 3: सेल गतिशीलता सेल ध्रुवीकरण और दिशात्मक संवेदन के साथ uncoupled है . ए छवि से पता चलता है कि actin polymerization अवरोध करनेवाला Latrunculin बी के उपचार के द्वारा स्थिर कोशिकाओं दिशात्मक संवेदन की क्षमता बनाए रखने के. कक्ष रंज 3 जांच, पीएच GFP (ग्रीन) व्यक्त करते हैं. ग्रैडिएंट (लाल) Alexa 594 के द्वारा कल्पना बी Manipulatable शिविर उत्तेजना और स्थिर सेल प्रणाली के लिए दिशात्मक संवेदन के प्रमुख सवालों के पते की अनुमति देता है. स्केल बार = 10μm.

चित्रा 4
चित्रा 4: एक स्थिर ढाल करने के लिए जोखिम पर संकेतन नेटवर्क chemosensing के कैनेटीक्स के प्रणालीगत माप. ए संग्रथित से पता चलता है रंज 3 उत्पादन के कैनेटीक्स सी. सी में प्रस्तुत की माप के लिए सेल के एक biphasic रंज 3 (ग्रीन) उत्पादन जो एक स्थिर शिविर ढाल (लाल) को उजागर बी छवि हितों के क्षेत्रों (ROIs) से पता चलता है कैनेटीक्स. ओएक स्थिर ढाल करने के लिए संपर्क में कोशिकाओं में च 3 रंज उत्पादन डी. स्कीम रंज 3 उत्पादन के लिए शिविर उत्तेजना से दिशात्मक संवेदन की संकेतन नेटवर्क से पता चलता है. एक स्थिर ढाल करने के लिए जोखिम पर उनकी कैनेटीक्स ई में एक ही रंग ठोस लाइनों में प्रस्तुत किया है.

चित्रा 5
चित्रा 5: GPCR संकेतन नेटवर्क के साथ - साथ निगरानी घटनाओं बहु. ए स्कीम निगरानी परिवर्तन और PIP3 जांच, जी और पीएच कोशिकाओं में पीएच GFP, क्रमशः की झिल्ली स्थानान्तरण झल्लाहट heterotrimeric जी प्रोटीन सक्रियण और pip 3 उत्पादन के युगपत माप से पता चलता है बी असेंबल इंद्रधनुष जी और पीएच कोशिकाओं की छवियों का पता चलता है. कि एक समान लागू शिविर उत्तेजना परिधीय सेल में एक लगातार जी प्रोटीन सक्रियण चलाता है, जबकि जो एक क्षणिक PIP3 उत्पादन हो सके. समय अंक 10.2s, 4.9s और 20.4s के लिए (0) से पहले और उत्तेजना के बाद सी. जी प्रोटीन सक्रियण और एक समान लागू शिविर उत्तेजना पर PIP3 उत्पादन के कैनेटीक्स.

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Discussion

कक्षों की chemotactic सक्षम मंच तक पहुँचने की प्रक्रिया

जंगली प्रकार के लिए डी. discoideum कोशिकाओं, यह लेता है के बारे में 5 ~ 6 घंटे कमरे के तापमान पर विकास स्पंदन उन्हें एक अच्छी तरह से chemotactic सक्षम चरण के दौरान जो कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से polarized सेलुलर आकारिकी और तेजी से सेल प्रवास (छवि 1) प्रदर्शन में प्रेरित. स्पंदन, तापमान, और अलग अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए एकाग्रता शिविर के रूप में कई कारकों, chemotactic सक्षम मंच तक पहुँचने की प्रक्रिया को प्रभावित कर सकता है. एक शिविर ढाल गाइड कोशिकाओं शिविर का स्रोत, एक निर्देशित सेल प्रवास chemotaxis के रूप में नामित की ओर स्थानांतरित करने के लिए. Polarized आकारिकी और तेजी से सेल आंदोलन: हालांकि, कोशिकाओं है कि chemotactic सक्षम अपर्याप्त विकास या अपने आनुवंशिक पृष्ठभूमि के कारण मंच तक पहुँच नहीं है दो विशिष्ट सुविधाओं नहीं दिखा सकते हैं. दूसरी ओर, कोशिकाओं है कि अधिक विकास की वजह से chemotactic सक्षम चरण बीत चुके हैं अक्सर कोशिकाओं के clumps, जो बहुत मुश्किल इमेजिंग प्रयोगों के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं में अलग हैं के रूप में ..

1. इमेजिंग एक दृश्य और manipulatable chemoattractant ढाल में chemotaxing कोशिकाओं

यह एक तकनीकी अग्रिम के लिए एक प्रायोगिक प्रणाली में fluorescently लेबल और manipulatable chemoattractant उत्तेजना लागू है. ऐतिहासिक, हम या तो homogenously लागू (भी बुलाया वर्दी उत्तेजना) उत्तेजना या ढाल उत्तेजना सेल आकारिकी और व्यवहार का निरीक्षण आवेदन किया था. हालांकि, एक "अंधा" उत्तेजना गति स्थानिक कैसे उत्तेजनाओं कोशिकाओं तक पहुँचता है पर कोई जानकारी नहीं दिखाता है, इसलिए किसी भी सेल प्रतिक्रियाओं के एक "असामान्य" टिप्पणियों पर संदेह निर्मोक. यहाँ, हम chemoattractant और निगरानी फ्लोरोसेंट दिन की तीव्रता की एकाग्रता और (छवि 2A, बी) के बीच एक रैखिक संबंध स्थापित करने के लिए chemoattractant के साथ फ्लोरोसेंट रंजक (Alexa594, आण्विक जांच) के एक आवेदन दिखा. हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और फ्लोरोसेंट डाई (Alexa594) के लाल उत्सर्जन है जो हमें दोनों एक उत्तेजना और इस उत्तेजना पर सेल प्रतिक्रिया (छवि 2C) पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है एक अधिग्रहण संयोजन.

प्रयोगात्मक आवश्यकता के अनुसार, वहाँ अधिक उपलब्ध संयोजन कर रहे हैं. जबकि एक नई फ्लोरोसेंट रंजक पर विचार, यह पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है फ्लोरोसेंट अपने प्रयोग के लिए उपयुक्त है, एक ढाल के प्रयोग के लिए विशेष रूप से, यह महत्वपूर्ण है अपने उत्तेजनाओं और फ्लोरोसेंट डाई सह दक्षता के प्रसार की पुष्टि. इसके अलावा, उत्तेजनाओं और मिश्रित फ्लोरोसेंट रंजक की एकाग्रता की तीव्रता के क्रम में एक रैखिक संबंध प्राप्त करने के लिए, यह तीव्रता के संतृप्ति के बिना उत्तेजनाओं की अधिकतम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.

2. स्थिर nonpolarized सेल रहते सेल इमेजिंग प्रणाली की सुविधा

Chemotaxis एक जटिल सेलुलर प्रक्रिया है, तथापि, यह तीन बुनियादी पहलुओं में dissected किया जा सकता है: सेलुलर ध्रुवीकरण, गतिशीलता, और दिशात्मक संवेदन. आकृति विज्ञान, एक का ध्रुवीकरण एक स्पष्ट रूप से परिभाषित अग्रणी सामने और एक सेल के बढ़ते अंत करने के लिए भेजा है. कई संकेत chemotaxis में शामिल घटकों या एक polarized कोशिकाओं में वापस fornt में स्थानीयकरण. दिशात्मक संवेदन एक polarized intracellular जैव रासायनिक ध्रुवीकरण में एक बाह्य ढाल अनुवाद के लिए एक सेल की क्षमता है. के रूप में छवि में दिखाया गया है. 3A, actin polymerization अवरोध करनेवाला (Latrunculin बी) के साथ कोशिकाओं के उपचार तेजी से सेल की गतिशीलता और अपने मूल ध्रुवीकरण समाप्त. Strikingly, कोशिकाओं को अभी भी कर रहे हैं ढाल (PIP3biosensor द्वारा एक अर्द्ध चंद्राकार, पीएच - GFP के रूप में दिखाया गया है) का सामना करना पड़ कोशिकाओं के सामने 3 रंज का एक संग्रह के रूप में एक intracellular ध्रुवीकरण, स्थापित करने में सक्षम है, यह दर्शाता है कि कोशिकाओं के दिशात्मक संवेदन किया जा सकता है सेल ध्रुवीकरण और सेल गतिशीलता से uncoupled. यह गैर polarized सेल प्रणाली हमें सेल गतिशीलता और पिछले ध्रुवीकरण की जटिलता के बिना chemosensing के लिए आवश्यक घटक के संकेत के कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. प्रो और चुनाव, actin polymerization अवरोध करनेवाला के उपचार के सभी गतिशीलता है कि actin-cytoskeleton पर आश्रितों. Abolishes

3. मॉनिटरिंग बहु वर्णक्रमीय लाइव सेल इमेजिंग द्वारा संकेतन नेटवर्क

अपनी रिसेप्टर के लिए शिविर की सगाई heterotrimeric जी प्रोटीन के सक्रियण चलाता है. के रूप में एक बाद में, Gβγ Gα सबयूनिट से सबयूनिट dissociates और बहाव effectors सक्रिय सेल PIP3 उत्पादन के रूप में ऐसी प्रतिक्रियाओं को प्रेरित. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी टेम्पो - स्थानिक संकल्प पर तकनीकी प्रगति subcellular स्तर पर जीवित कोशिकाओं में कई संकेत घटनाओं के एक साथ इमेजिंग अनुमति देते हैं. इस खंड में, हम पहली बार निगरानी शिविर ढाल (4A छवि) के साथ साथ दो संकेतन अणुओं के एक साथ इमेजिंग दिखा. अगला, हम जी सक्रियण और PIP3 उत्पादन (4B छवि) के बहाव के सेल प्रतिक्रिया के वर्णक्रमीय इमेजिंग उपस्थित थे. फॉर्स्टरप्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (संक्षिप्त झल्लाहट), प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण, प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (रेत) या इलेक्ट्रॉनिक ऊर्जा हस्तांतरण (EET) के रूप में भी जाना जाता है, एक दो chromophores के बीच ऊर्जा के हस्तांतरण का वर्णन तंत्र है. वहाँ की घटना के लिए तीन मानदंड हैं झल्लाहट: दाता स्वीकर्ता उत्सर्जन और उत्तेजना, उचित उन्मुखीकरण, और छोटी दूरी (<10 एनएम) के ओवरलैप. दो अणुओं की आवश्यकता / दूरी उन्मुखीकरण की सुविधा प्रोटीन, प्रोटीन या प्रोटीन के intromolecular रचना परिवर्तन बातचीत का पता लगाने के लिए एक कुशल तरीका हो झल्लाहट. यहाँ, हम आम इस्तेमाल किया CFP / YFP जोड़ी (Gα-CFP/Gβ-YFP) झल्लाहट करने के लिए जीवित कोशिकाओं में जी प्रोटीन α / सब यूनिटों βγ के गतिशील पृथक्करण की निगरानी. इस्तेमाल किया के रूप में हम यहाँ वर्णित एक चतुर प्रयोगात्मक डिजाइन करने के क्रम में कोशिकाओं के दो विभिन्न प्रकार के मिश्रण करने के लिए एक साथ दोनों जी प्रोटीन सक्रियण और PIP3 उत्पादन की निगरानी जब यह एक कक्ष में सभी गतिशीलता को मापने के लिए सुविधाजनक नहीं है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम NIAID, NIH से अंदर कोष द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D3-T Growth Media KD Medical
Caffeine Sigma-Aldrich
Latrunculin B Molecular Probes, Life Technologies
Alexa 594 Molecular Probes, Life Technologies
cAMP Sigma-Aldrich
ChronTrol XT programmable timer ChronTrol Corp
Miniplus 3 peristaltic pump Gilbson
Platform rotary shaker
FemtoJet microcapillary pressure supply Eppendorf
Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers Nalge Nunc international
LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope Carl Zeiss, Inc. a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens
Olympus X81 or equivalent Olympus Corporation Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens

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