Summary
Aqui, descrevemos os métodos detalhados de células vivas de imagem para investigar quimiotaxia. Apresentamos fluorescência métodos microscópicos para monitorar a dinâmica espaço-temporal dos eventos de sinalização em células migratórias. Medição dos eventos de sinalização nos permite entender melhor como uma rede de sinalização GPCR-alcança gradiente de detecção de quimioatrativos e controles de migração direcional das células eucarióticas.
Abstract
Muitas células eucarióticas pode detectar gradientes de sinais químicos em seus ambientes e migrar de acordo 1. Esta migração celular guiada é referido como quimiotaxia, que é essencial para várias células para realizar suas funções, tais como tráfico de células do sistema imunológico e padronização de células neuronais 2, 3. A grande família de G receptores acoplados à proteína (GPCRs) detecta variável pequenos peptídeos, conhecido como quimiocinas, para dirigir a migração celular in vivo 4. O objetivo final da quimiotaxia pesquisa é compreender como um sentidos máquinas GPCR quimiocina gradientes e controles de sinalização eventos que levam a quimiotaxia. Para este fim, usamos técnicas de imagem para monitorar, em tempo real, as concentrações de espaço-temporal de quimioatrativos movimento celular, em um gradiente de chemoattractant, GPCR mediada ativação da proteína G-heterotrimeric, e eventos de sinalização intracelular envolvidas na quimiotaxia de células eucarióticas 08/05 . O organismo simples eucarióticas, Dictyostelium discoideum, exibe comportamentos quimiotático que são semelhantes aos de leucócitos, e D. discoideum é um sistema modelo para estudar a quimiotaxia chave eucarióticas. Como amebas de vida livre, D. discoideum células dividem-se em meio rico. Após a fome, as células entrar em um programa de desenvolvimento em que agregada através AMPc mediada por quimiotaxia para formar estruturas multicullular. Muitos componentes envolvidos na quimiotaxia ao AMPc foram identificados em D. discoideum. A ligação de AMPc a um GPCR (car1) induz a dissociação da heterotrimeric G-proteínas em Gγ e subunidades Gβγ 7, 9, 10. Subunidades Gβγ ativar Ras, que por sua vez ativa PI3K, convertendo PIP PIP 2 em 3 na membrana celular 11-13. PIP 3 servem como sítios de ligação para proteínas com pleckstrin Homologia (PH) domínios, assim, o recrutamento dessas proteínas para a membrana 14, 15. Ativação de receptores car1 também controla as associações de membrana de PTEN, que desfosforila PIP PIP 3 a 2 16, 17. Os mecanismos moleculares são evolutivamente conservada em quimiotaxia quimiocina GPCR mediada das células humanas, tais como neutrófilos 18. Nós apresentamos métodos a seguir para estudar a quimiotaxia de D. células discoideum. 1. Preparação de células componentes quimiotáticos. 2. Quimiotaxia de imagem de células em um gradiente de cAMP. 3. Monitoramento de uma ativação induzida de GPCR heterotrimeric proteína G-in único de células vivas. 4. Imagem PIP chemoattractant dinâmica desencadeada três respostas em um único células vivas em tempo real. Nossos métodos de imagem desenvolvida pode ser aplicada para estudar a quimiotaxia de leucócitos humanos.
Protocol
1. Preparação de células competentes quimiotática de Dictyostelium discoideum
- Para gerar células discoideum D. que são quimiotáticos para o acampamento chemoattractant, células colheita crescendo em D3-T rich media de uma cultura agitação a 22 ° C.
- Lave as células duas vezes em não-nutrientes tampão de desenvolvimento (buffer DB contendo 5 mM Na 2 HPO 4, 5 mM KH 2 PO 4, 2 mM MgCl 2, e 0,1 mM CaCl 2).
- Re-suspender as células em tampão DB a uma densidade de 2x10 7 células / ml.
- Agite 10 células ml em um frasco de 250 ml a 100 rpm a 22 ° C durante uma hora.
- Entregar 100 l de 7,5 mM de ações cAMP aos 10 células ml cada seis minutos mais de 6 horas para obter uma concentração final de 75 nM cAMP, um processo designado como tratamento cAMP pulsante. Após 5-6 horas de tratamento cAMP pulsante, D. células discoideum se tornar competente na direção do gradiente quimiotático cAMP.
- Coletar células por centrifugação a 200 g por 5 min e depois ressuspender as células com tampão contendo 2,5 DB cafeína mM, e agitar a 200 rpm a 22 ° C por 20 min para basolate célula para uma situação quimiotáticos.
2. Células imagem chemotaxing em um gradiente chemoattractant visível e manipulável
- Backfill micropipeta um com um recém-preparados 30 mL de solução de 1 mM cAMP e Alexa 594 em 0.1μg/μl em tampão DB.
- Anexar o Femtotip a um detentor micropipeta e conectar o tubo a um aparelho de alimentação de pressão, Eppendorf sistema FemtoJet.
- Prender o conjunto de micropipeta para um micromanipulador (Eppendorf TransferMan NK2) motorizada micromanipulador para fornecer uma pressão constante, a fim de estabelecer um gradiente estável.
- Montar uma bem-câmara LabTek preenchido com 6 ml de tampão DB sobre uma lente de 40X de óleo em um microscópio confocal e uso brilhante de campo óptica, o centro Femtotip para o campo de visão.
- Ligue a fonte de pressão e ajustar a pressão de compensação (Pc) para 70 hPa para estabelecer um gradiente de campo / Alexa 594 mistura.
- Visualize gradiente cAMP através do monitoramento da mistura de concentração desejada de cAMP e fluorescência Alexa 594 usando uma linha de excitação com laser de 543 nm.
- Use auto-posicionamento função do micromanipulador para colocar micropipeta para as posições desejadas e defini-las como posição 1, posição 2, 3 e posição para manipular o gradiente a que estão expostos a célula.
3. Sistema de célula de imóveis nonpolarized facilita eventos de imagens de sinalização envolvidos na cAMP gradiente de sensoriamento
- Após o tratamento a cafeína, retire uma alíquota de células e centrifugar a 500 g por 3 min.
- Remover tampão e diluir as células a 5x10 5 células / ml com tampão contendo 2,5 DB fresco cafeína mM.
- Aplicar 1 ml de suspensão de células de uma única câmara-assim ou 0,4 ml a cada poço de uma câmara de quatro bem.
- Permitir que as células aderem por 10 min, com cuidado pipeta fora do tampão para remover as células solto e substituir com o mesmo volume.
- Localizar as células desejadas sob o microscópio e começar de imagem.
- Para um experimento projetado para monitorar a dinâmica de sinalização nas células componentes expondo a um gradiente estabilizado, tratar as células com 5,0 mM (concentração final) Latrunculin B por 10 min antes dos experimentos.
4. Simultânea de monitoramento heterotrimeric ativação da proteína G e PIP 3 produção
- cAMP pulsando desenvolver células co-expressando GαCFP e YFPGβ (células G) e células que expressam PIP 3 Indicador de PH GFP (células PH) 7.
- Misture estes dois tipos de células com relação de 1:1 e placa-los em câmaras de um bem ou quatro poços.
- Criar e salvar a emissão de impressões digitais de referência da curva PCP, YFP e GFP utilizando Lambda modo de Aquisição de pilha dentro da faixa espectral 464-624 nm com uma largura de 10 nm.
- Simultaneamente ativação da proteína G de imagem em células G e produção PIP 3 em células PH usando com o mesmo modo de Aquisição Stack Lambda dentro da faixa espectral 464-544 nm com incrementos de 10 nm.
- Aplicar função desmistura Linear Zeiss de software usando 510META salvo CFPand YFP e impressões digitais de emissão para calcular matematicamente a contribuição de cada fluoróforo na Stack Lambda para separar o PCP ea intensidade YFP em canais individuais em G.
- Com a mesma estratégia, aplicar função desmistura Linear usando GFP salvos e impressões digitais de emissão de fundo para calcular matematicamente intensidade GFP em células PH.
5. Resultados representativos:
- Um sistema excelente modelo de D. discoideum para GPCR quimiotaxia mediada. A ameba social, D. discoideum exibe uma impressionante quimiotaxia durante o ciclo de vida. Devido às suas vantagens genéticas e bioquímicas, D. d fornece uma poderosa sistema para estudar a quimiotaxia.
- Quimiotaxia de células em um campo visível e manipulável chemoattract. Aqui, mostramos primeiro uma metodologia simples para obter uma relação linear entre a concentração de cAMP e da intensidade de um corante fluorescente Alexa 594 por uma série de diluição de 2 cAMP M misturado com 10 mg / mL Alexa 594 (Fig. 2A). Em seguida, fornecer uma maneira fácil de visualizar o gradiente, além disso, estabelecer uma medida quantitativa da concentração de cAMP de um gradiente pela intensidade do Alexa 594 (Fig. Fig.. 2B).
- Motilidade celular é desacoplado com polarização celular e detecção direcional. Um inibidor de polimerização de actina elimina pré-existentes polaridade morfológicas e também impede a movimentação das células, mantendo a capacidade das células de detecção direcional (Fig. 3A). Emprego de estimulação cAMP visível e manipulável garante a entrada, por exemplo estímulos uniformemente aplicada ou um gradiente. Este método permite uma análise quantitativa de AMPc induzida redistribuição dos principais componentes de sinalização nas máquinas gradiente de detecção. Medida dinâmica espaço-temporal destes componentes de sinalização nos permitem compreender como a rede de sinalização alcança a adaptação aos estímulos uniforme ao gerar polarizada respostas bioquímicas a gradientes (Fig. 3B).
- Medições sistêmica da cinética de chemosensing rede de sinalização após a exposição a um gradiente constante. É fundamental para medir a dinâmica / cinética da direcionais de detecção de sinalização componentes para entender como cada componente contribui para o estabelecimento de polarização intracelular quando as células experiência primeiro gradiente. Aplicação de imagens de células vivas com um ritmo de alta resolução espacial, primeiro mostrar uma produção PIP3 bifásica de celular que é exposto a um gradiente de cAMP constante (Fig. 4A-C). Aplicação de imagens de células vivas, temos sistematicamente medida dinâmica da direcionais de detecção de rede de sinalização específicas de estímulo para cAMP PIP3 de produção (Fig. 4D, E).
- Simultânea de monitoramento ativação da proteína G e heterotrimeric PIP 3 a estimulação da produção de AMPc uniformemente aplicadas. Förster ressonância a transferência de energia (abreviado FRET) constitui uma estratégia eficiente para monitorar a ativação da proteína G heterotrimeric (dissociação) com a estimulação do AMPc. Aqui, descrevemos um sistema de fácil adotar conveniente para uma medição simultânea de ativação da proteína G heterotrimeric e produção PIP 3 monitorando o FRET mudança e translocação de membrana de PIP 3 sonda, PH GFP-in G e células PH, respectivamente (Fig. 5 ). A estimulação cAMP uniformemente aplicadas desencadeia uma ativação da proteína G persistente, enquanto que desencadeia um transiente PIP 3 produção.
Figura 1: Um sistema excelente modelo de D. discoideum para quimiotaxia mediada GPCR. A. Esquema mostra um caminho breve sinalização de detecção direcional. B. gradiente AMPc induz quimiotaxia rápida de D. células discoideum. Células expressam sonda PIP 3, PH-GFP (Green). Gradiente (Red) é visualizado por Alexa 594. Barra de escala = 50 ìm.
Figura 2: Quimiotaxia de células sob uma campos visíveis e manipuláveis chemoattract. A. Gráfico mostra uma relação linear entre a concentração de cAMP e da intensidade de um corante fluorescente Alexa 594 por uma série de diluição de 2 cAMP M misturado com 10 mg / mL Alexa 594. B. Determinação quantitativa da concentração de cAMP de um gradiente pela relação linear da concentração de cAMP e intensidade do corante fluorescente Alexa em 594 A.
Figura 3: motilidade celular é desacoplado com polarização celular e detecção direcional. Imagem A. mostra que as células imóvel pelo tratamento de actina inibidor de polimerização Latrunculin B manter a capacidade de detecção direcional. Células expressam sonda PIP 3, PH-GFP (Green). Gradiente (Red) é visualizado por Alexa 594. B. cAMP manipulável sistema de célula de estimulação e imóvel permite abordar questões-chave de detecção direcional. Barra de escala = 10μm.
Figura 4: medidas sistêmicas da cinética de chemosensing rede de sinalização após a exposição a um gradiente constante. A. Montagem mostra um bifásico PIP 3 produção (Verde) do celular que é exposto a um gradiente de cAMP estacionário (vermelho). B. A imagem mostra as regiões de interesse (ROIs) para a medição da cinética de produção PIP 3 apresentados em C. C . Kinetics of PIP 3 de produção nas células expostas a um gradiente constante. D. Esquema mostra a rede de sinalização de detecção direcional de estímulo à produção de cAMP PIP 3. Sua cinética após a exposição a um gradiente de equilíbrio é apresentado nas linhas de mesma cor sólida em E.
Figura 5: monitoramento simultâneo de vários eventos de redes GPCR sinalização. Esquema de A. mostra a medição simultânea de ativação da proteína G heterotrimeric e produção PIP 3 monitorando o FRET mudança e translocação de membrana de PIP3 sonda, PH-GFP em células G e PH, respectivamente. B. Montagem de imagens arco-íris de G e células PH mostra que um estímulo cAMP uniformemente aplicadas desencadeia uma ativação da proteína G persistente na célula periféricos, enquanto que desencadeia uma produção PIP3 transitória. Os momentos são antes (0s) e após a estimulação para 4.9s, 10.2s e 20.4s. C. Cinética de ativação da proteína G e PIP3 produção em cima de um estímulo cAMP uniformemente aplicadas.
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Discussion
Os processos de atingir estágio competente quimiotáticos de células
Para o tipo selvagem D. células discoideum, leva cerca de 5 ~ 6 horas pulsando desenvolvimento à temperatura ambiente para induzi-los em um estágio bem quimiotáticos competente durante o qual células apresentam uma morfologia bem polarizada celular e migração celular rápida (Fig. 1). Vários fatores, tais como a concentração de cAMP pulsação, temperatura e diferentes origens genéticas, podem afetar o processo de alcançar estágio competente quimiotáticos. Um guia gradiente cAMP as células a se mover em direção à fonte de cAMP, a migração celular dirigido designado como quimiotaxia. No entanto, as células que não atingiram o estágio quimiotáticos competentes devido ao desenvolvimento insuficiente ou sua origem genética não pode mostrar duas características típicas: morfologia polarizada e movimento celular rápida. Por outro lado, as células que já passaram a fase quimiotáticos competente devido ao sobre-desenvolvimento muitas vezes formam aglomerados de células, que são muito difíceis de separar em células individuais para experimentos com imagens ..
1. Células imagem chemotaxing em um gradiente chemoattractant visível e manipulável
É um avanço técnico para aplicar fluorescente etiquetado e manipulável estimulação chemoattractant em um sistema experimental. Historicamente, tivemos aplicada ou aplicada de forma homogénea a estimulação (também chamada estimulação uniforme) ou estimulação gradiente para observar a morfologia das células e comportamentos. No entanto, um estímulo "às cegas" mostra nenhuma informação tempo-espacial sobre como os estímulos atinge as células, portanto, lança dúvidas sobre qualquer "anormal" observações de respostas das células. Aqui, nós mostramos uma aplicação de tinta fluorescente (Alexa594 Probe, Molecular) com chemoattractant estabelecer uma relação linear entre a concentração de chemoattractant e intensidade do dia fluorescente e monitorados (Fig. 2A, B). Uma combinação de aquisição de proteína verde fluorescente (GFP) e uma emissão vermelha do corante fluorescente (Alexa594), que nos permite monitorar tanto estímulo e uma resposta sobre esta estimulação de células (Fig. 2C).
De acordo com a exigência experimental, há mais combinações disponíveis. Apesar de considerar um novo corante fluorescente, é fundamental para confirmar a fluorescente é adequado para a sua experiência, especialmente para um experimento de gradiente, é importante para confirmar a difusão co-eficiência dos seus estímulos e corante fluorescente. Além disso, a fim de obter uma relação linear de estímulos concentração e intensidade do corante fluorescente mista, é necessário adquirir a concentração máxima de estímulos sem saturação de intensidade.
2. Sistema de célula de imóveis nonpolarized facilita imagens de células vivas
Quimiotaxia é um processo complicado celulares, no entanto, pode ser dissecado em três aspectos básicos: a polarização celular, motilidade, e sensoriamento direcional. Morfologicamente, a polarização do um é chamado de uma frente claramente definidos líder e fim de fuga de um celular. Muitos componentes de sinalização envolvidos na quimiotaxia localizar em qualquer fornt ou a volta em um células polarizadas. Direcionais de detecção é a capacidade de uma célula para traduzir um gradiente extracelular em uma polarização intracelular polarizada bioquímicos. Como mostrado na figura. 3A, o tratamento de células com polimerização de actina inibidor (Latrunculin B) rapidamente elimina motilidade celular e sua polarização original. Surpreendentemente, as células ainda são capazes de estabelecer uma polarização intracelulares, tais como um acúmulo de PIP 3 na parte da frente das células de frente para o gradiente (mostrado como um crescente por PIP3biosensor, PH-GFP), indicando que sensoriamento direcional das células pode ser desacoplado da polarização celular e motilidade celular. Este sistema de célula não-polarizado nos permite determinar a cinética de sinalização componentes essenciais para chemosensing sem a complicação de motilidade celular e polarização anterior. Prós e contras, o tratamento de inibidor de polimerização de actina abole toda a dinâmica que os dependentes de actina do citoesqueleto.
3. Rede de monitoramento de sinalização por multi-espectral imagens de células vivas
Engajamento de cAMP ao seu receptor desencadeia a ativação da proteína G heterotrimeric. Como, posteriormente, se dissocia Gβγ subunidade da subunidade Gα e ativa efetores downstream de induzir respostas celulares, como PIP3 produção. Avanços tecnológicos em tempo-espacial resolução de microscopia de fluorescência permitem uma gravação simultânea de diversos eventos de sinalização a nível subcelular em células vivas. Nesta seção, primeiro mostrar uma imagem simultânea de duas moléculas de sinalização junto com gradiente de monitoramento cAMP (Fig. 4A). Em seguida, apresentamos imagem espectral de G ativação e sua resposta celular a jusante do PIP3 de produção (Fig. 4B). Försterressonância a transferência de energia (abreviado FRET), também conhecida como transferência de energia de ressonância de fluorescência, ressonância transferência de energia (RET) ou transferência de energia eletrônica (EET), é um mecanismo que descreve a transferência de energia entre dois cromóforos. Há três critérios para a ocorrência de FRET: sobreposição de emissão do doador e aceitador de excitação, a orientação adequada e curta distância (<10 nm). A exigência de educação a distância / orientação de duas moléculas facilita FRET ser uma maneira eficiente para detectar a interação proteína-proteína ou alterar a conformação intromolecular de uma proteína. Aqui, usamos o comum usado CFP / YFP FRET par (Gα-CFP/Gβ-YFP) para monitorar a dissociação dinâmica da proteína G α / βγ subunidades em células vivas. Como um design inteligente experimental que descrevemos aqui é para misturar dois tipos diferentes de células, a fim de monitorar simultaneamente a ativação da proteína G e PIP3 produção quando não é conveniente para medir todas as dinâmicas em uma célula.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo fundo intramural do NIAID, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma-Aldrich | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| cAMP | Sigma-Aldrich | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc international | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Carl Zeiss, Inc. | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus Corporation | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
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