Emballagen HIV-eller FIV-baserede Lentivector ekspressionskonstruktioner og transduktion af VSV-G-pseudotypet virale partikler

Summary

Lentivirale ekspressionsvektorer er de mest effektive køretøjer til stabilt at udtrykke forskellige effektormolekyler eller reporterkonstruktioner i delende og ikke-delende mammale celler og hele organismer. Her giver vi en protokol om, hvordan man pakker lentivector ekspressionskonstrukter i pseudoviral partikler og transducere målceller ved hjælp af de pseudoviral partikler.

Abstract

Som med standard plasmidvektorer, er det muligt at transficere lentivectors i plasmid form i celler med lav-til-medium effektivitet til opnåelse af forbigående ekspression af effektorer. Emballage lentivirale ekspressionskonstruktioner til pseudoviral partikler imidlertid muligt op til 100% transduktion, selv med vanskelige at transficere celler, såsom primære, stilk og differentierede celler. Endvidere har lentiviral levering ikke frembringe de specifikke cellulære responser typisk er forbundet med kemiske transfektioner, såsom celledød som følge af toksiciteten af transfektionsreagens ^{1, 2.} Når transducerede i målceller, den lentivirale konstruktionen integreres i genomisk DNA og tilvejebringer stabil ekspression af det lille hårnålen RNA (shRNA), cDNA microRNA eller reportergen ^{3, 4.} Målceller stabilt udtrykker effektor-molekyle kan isoleres ved anvendelse af en selekterbar markør, der er indeholdt i ekspressionsvektoren konstruktionen såsom puromycin eller GFP. Efter pseudoviral partikler inficere målceller, kan de ikke replikere i målceller, fordi de virale strukturelle gener er fraværende, og de ​​lange terminale repeats (LTR'er) er udformet til at være selv-inaktiverende ved transduktion ^{5, 6.}

Der er tre hovedkomponenter, der er nødvendige for effektiv lentiviral emballage ^{1, 5, 6, 7.}

1. Den lentiviral ekspressionsvektor, der indeholder nogle af de genetiske elementer, som kræves til emballering stabil integration af det virale ekspressionskonstruktion i genomisk DNA, og ekspression af effektor-eller reporter.
2. De lentivirale emballage plasmider, som giver de proteiner nødvendige for transkription og emballering af en RNA-kopi af ekspressionskonstruktionen i rekombinante pseudoviral partikler. Denne protokol anvender PPACK plasmider (SBI), der koder for gag, pol, og rev fra HIV eller FIV-genomet og vesikulær stomatitis-virus G-protein (VSV-G) for det virale kappeprotein.
3. 293TN producere R-celler (afledt fra HEK293-celler), som udtrykker SV40 stort T-antigen, som er nødvendig for høj titer lentiviral produktion og et neomycinresistensgen, anvendelige til reselecting cellerne for vedligeholdelse.

En oversigt over virusproduktion protokol kan ses i figur 1. Viral produktion begynder ved co-transfektion 293TN producerende celler med lentiviral ekspressionsvektoren og emballering plasmider. Virale partikler udskilles i mediet. Efter 48-72 timer cellekulturen mediet høstes. Cellerester fjernes fra celledyrkningsmedier, og de virale partikler udfældes ved centrifugering med PEG-det for koncentration. Fremstillet lentivirale partikler derefter titreret og kan anvendes til at transducere målceller. Nærmere oplysninger om viral titrering er ikke medtaget i denne protokol, men kan findes på:

ANK "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ^8.

Denne protokol er blevet optimeret ved hjælp af de specifikke produkter, der er angivet. Andre reagenser kan være substitueret, men de samme resultater ikke kan garanteres.

Protocol

1. Transfektion af 293TN Celler med Emballage plasmider og ekspressionskonstruktionen

1. Frø 7,0-8,0 x 10 ⁶ 293TN celler pr 15 ^cm2 dyrkningsplade med 20 ml dyrkningsmedium indeholdende DMEM-medium suppleret med 4 mM L-glutamin, 4,5 g / l glucose, og føtalt bovint serum (10%) uden antibiotika. Vokse i 18-24 timer ved 37 ° C med 5% CO _2, således at celledensiteten når 60-80% konfluens ved transfektion. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at frø flere plader af celler for at opnå en tilstrækkelig høj titer til transduktion af målceller.
2. For hver plade af celler, tilsættes 1,6 ml serumfrit DMEM til en autoklaveret 2 ml Eppendorff rør. Tilsæt 45 ul pPACKH1 eller pPACKF1 og 4,5 ug af din lentivector konstruere til DMEM og bland ved pipettering op og ned.
3. Tilsættes 55 ul PureFection i det samme rør. Vortex i 10 sekunder. Inkubér DMEM-Plasmid-PureFection blandingen ved stuetemperatur feller 15 min.
4. Tilføje DMEM-Plasmid-PureFection blandingen til vævskulturplade dråbevis og bland forsigtigt til jævnt dispergeret i hele pladen. Retur retten til inkubator og vokse ved 37 ° C med 5% CO _2.
5. Der er ikke behov for at ændre mediet efter transfektion. Hvis din lentivector konstruktion udtrykker et gen, der koder for et fluorescerende protein som GFP, så tjek dine celler under et mikroskop 12-24 timer efter transfektion. De skal være i stand til at se> 90% GFP-positive celler, hvilket indikerer, at transfektionen var vellykket.
6. Opsaml cellekultursupernatanten efter 48 og 72 timer i et 50 ml sterilt centrifugerør. Dette cellekultursupernatant indeholder nu infektiøse pseudoviral partikler. (Følg anbefalede retningslinjer for arbejdet med BSL-2 sikkerhedsklasse.) Centrifuger ved 1.500 xg i 15 min ved stuetemperatur til pellet celleresterne. Overfør den virale supernatant til et nyt rør, sikrer ikke at forstyrre pellet.
7. 293TN celler der er blevet anvendt for viral pakning skal bortskaffes i en biologisk beholder og skal ikke anvendes til yderligere runder af viral pakning.

2. Koncentrationen af ​​viral supernatant

1. Tilsættes en mængde koldt (4 ° C) PEG-det Virus Udfældning opløsning til hver 4 volumener lentiviral partikel-indeholdende supernatant. Udfældning af lentivirale partikler fra store mængder kan opnås med Corning 250 ml polypropylen centrifugerør. Bland den løsning, ved at vende de rør flere gange, men det gør ikke vortex blandingen.
2. Afkøles opløsningen ved 4 ° C i mindst 12 timer (op til 4 dage er acceptabelt). Undgå at ryste eller rotere rørene under køle-trin.
3. Centrifugeres supernatanten / PEG-det blandingen ved 1500 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Efter centrifugering vil lentivirale partikler fremtræder som et beigefarvet eller hvid pellet ved bunden af ​​røret. Hæld ud supernatant.
4. Fjern alle spor af væske ved aspiration, pas på ikke at forstyrre de udfældede lentiviral partikler i pellet. Spor af tilbageværende PEG-det vil fortynde virus (og dermed reducere titeren), men vil ikke påvirke integriteten af ​​målcellerne, idet PEG-den er inert og ikke toksisk.
5. Resuspender og kombinere de lentivirale partiklerne i 1/100 af det oprindelige volumen ved hjælp af kold (4 ° C), steril phosphatpufret saltvand eller DMEM indeholdende 25 mM HEPES-puffer.
6. Alikvot i sterile kryogene hætteglas og opbevares ved -70 ° C indtil den er klar til brug.

3. Viral titrering og transduktion af målceller

1. Vi anbefaler titrering de lentivirale partiklerne før transduktion af target-celler af interesse, og beregne den passende multiplicitet af infektion (MOI) for målcellerne for sammenhængen mellem forsøgene. For viral titrering, anbefaler vi at bruge HT1080 celler som en nem at inficere positiv kontrol linje. Pllette bemærke, at titrering Protokollen involverer transduktion HT1080-celler med en lille portion af lentivirale partiklerne De har pakket. Når titeren er kendt, kan målcellerne af interesse også transduceret med de producerede lentivirale partikler. En anbefaler titrering protokol kan findes på: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf ^7.
2. Plade 50.000 målceller af interesse per brønd i en 24-brønds plade i celledyrkningsmedier. Brug medierne, at cellerne normalt er dyrket i. Grow cellerne natten på deres specificerede dyrkningsbetingelser. Cellerne bør være mellem 50 til 70% konfluente på dagen for transduktion.
3. På dagen for transduktion, aspireres medierne fra cellerne. Kombiner dyrkningsmedium med TransDux til en 1 x slutkoncentration (for eksempel 2,5 pi TransDux til 500 pi kulturmedium). Derefter overføre TransDux-cell dyrkningsmedium blanding til hver brønd.
4. Pipettere det passende volumen af ​​virus, der svarer til den optimale MOI for målcellerne i hver brønd. Hvis den optimale MOI er ukendt, anbefales forsøger en række forskellige MOI (såsom en MOI på 1, 2 og 5 for let at inficere vævskulturceller, og en MOI på 1, 10 og 20 for mere vanskeligt at -infektion af primære celler). Hvis koncentrationen af ​​lentivirale partikler ikke er kendt (som bestemt ved hjælp af en virus titrering protokol), kan forskellige mængder virus prøves, såsom 1, 2 og 5 pi af virus. Virus kan forblive i kontakt med målcellerne i op til 72 timer.
5. Yderligere eksperimenter med transducerede målcellerne af interesse kan påbegyndes 72 timer efter transduktion, når viral konstruktion er integreret i værtscellegenomet. Skift medium og passagen målet celler-of-renter i henhold til deres specifikke behov.

4. Repræsentative resultater

Start densitet af 293TN celler er kritiske for vellykket viral pakning. 293TN celler skal være mellem 60 -80% konfluente dagen for transfektion (fig. 2). Hvis 293TN cellerne er mindre end 60% sammenflydende, give dem mulighed for at vokse et par timer mere, før du forsøger transfektion. Hvis de 293TN celler> 80% sammenflydende, bør de genudplades før transfektion.

Hvis der anvendes en lentivector udtrykker GFP, bør mindst 90% af 293TN cellerne fluorescerer grønt 24 timer efter transfektion, hvilket indikerer en vellykket transfektion (fig. 3). Hvis mindre end 90% af cellerne er GFP-positive, ikke fortsætte til næste trin, fordi det viser, at transfektion ikke blev gennemført, og de virale titere vil være lav. I stedet plade nye 293TN celler og starte forfra, og sørg for, at de 293TN cellerne er på rette celletæthed før transficering.

293TN celler kan trække væk fra vævskulturplader 48-72 timer efter transfektion. Dette er ikke negativt påvirke produktionen af ​​lentiviral partikler.

Titrering med HT1080-celler

Virale titere kan beregnes ved hjælp af SBI Global ultrarapid titrering kit ifølge producentens anvisninger. Dette system anvender qPCR at måle viral integration af WPRE sekvens fra den lentivirale vektor i HT1080 celler og sammenligner denne med en standardkurve, ud fra en genomisk referencesekvens at måle infektiøse enheder pr ml (figur 4).

Transduktion af målceller

Hvis du bruger lentiviral partikler, der udtrykker en konstitutivt aktiv GFP markør, skal GFP-positive celler begynder at dukke op inden for 12-24 timer efter transduktion, hvis transduktion reaktion arbejder. GFP udtryk bør fortsætte efter lentiviral konstruktion integreres stabilt i tHan værtscellegenomet. Hvis transducere med forskellige MOI bør GFP-fluorescens omtrent svarer til MOI, hvor lav MOI udviser mindre GFP-fluorescens og højere MOI udviser øget GFP fluorescens (fig. 5).

Figur 1. Oversigt over virusproduktion protokol. De lentivector og PPACK emballage plasmider blandet og co-transficeres ind i 293TN celler. Efter 48 -72 timer, er den virale supernatant opsamles og virale partikler udfældes med PEG-den. Efter titrering de lentivirale partikler, kan de anvendes til at transducere målet celler af interesse. Klik her for at se større figur .

Figur 2. Fasekontrast billede af 293TN celler. Cell DensitY skal være mellem 60-80% konfluente på dagen for transfektion.

Figur 3. Fluorescerende billede af GFP-positive 293TN celler 24 timer efter transfektion med Purefection, pPACKH1 og en lentivector konstruktion der koder for GFP.

Figur 4. WPRE qPCR resultater og standardkurve opnås ved hjælp af SBI Global ultrarapid titrering kit til at beregne MOI og tilsvarende titer af emballerede viruspartikler.

Figur 5. Fluorescerende billeder af HT1080-celler transduceret med stigende mængder af lentivirus. Billeder fra 72 timer efter transduktion.

Discussion

Dette viral pakning og transduktion af mål celler protokol er blevet optimeret til brug med SBI 's virale emballage reagenser. Substitution af andre reagenser kan påvirke resultatet af protokollen. Denne protokol er kun blevet optimeret til lentiviral produktion og kan ikke være egnet til fremstilling af andre typer virus eller pseudoviruses.

Vellykket viral emballage er afhængig af en række vigtige skridt. De 293TN celler udtrykker SV40 stort T-antigen, hvilket er absolut nødvendigt for sekretion af lentivirale partiklerne ind i cellekultursupernatanten. Massefylden ved hvilken 293TN celler ved transfektion er særlig vigtig, for at PureFection reagens tilstrækkelig overføre lentivector og emballering plasmider ind i celler. Tilsætning af PureFection blandingen til vævskulturplade i en dråbevis måde efterfulgt af grundig omrystning af pladen er vigtig for spredning af emballagen plasmiderog lentivector konstruere gennem hele celler. Manglende passende fordele vektorerne kan resultere i utilstrækkelig lentivirale partikler, der produceres. Den viral pakning Reaktionen kan opskaleres til fremstilling af høj titer virus, baseret på overfladearealet af vævskulturplader. Kan man vælge at pladen flere vævskulturskåle i 293TN celler pr konstruktion, der skal emballeres. Koncentrationen af ​​de virale supernatanter er især nyttig til at skabe høje titer virus. Viral supernatant fra multiple plader af celler kan kombineres og koncentreres til anvendelse i in vivo-forsøg, eller celler, der er vanskelige at transducere.

Titrering de fremstillede lentivirale partiklerne er vigtig for at beregne et nøjagtigt MOI til brug for transduktion af målceller. Kende MOI der blev anvendt i en given transduktion muliggør fejlfinding i tilfælde af, at transduktion ikke er vellykket. For eksempel ved anvendelse af en MOI, der erfor lav, kan resultere i meget få målceller udtrykker konstruktionen af ​​interesse. Anvendelse af en MOI, som er for høj, kan dog resultere i målceller, der viser tegn på stress. Målet er at anvende en MOI der maksimerer ekspression af konstruktionen af ​​interesse samtidig sundhed af cellerne. Selvom vi anbefaler qPCR baseret titrering protokol, der måler integrerede kopier af lentiviral konstruktionen i HT1080-celler, kan andre titrering fremgangsmåder også anvendes, såsom p24 ELISA eller estimering af procentdelen af ​​GFP-positive celler.

Vellykket transduktion af målceller er også afhængig af flere vigtige faktorer. TransDux er en unik infektion reagens, hvilket giver høj transduktion effektivitet, men som ikke er toksisk for celler. TransDux kan anvendes i stedet for polybren, som ofte er toksiske for målcellerne. Optagelse af TransDux i transduktionen af ​​målcellerne hjælper til at neutralisere ladninger på viruspartikler og tillader virusset ind i cellensek. Idet TransDux ikke er toksisk for cellerne, kan man tillade lentivirale partiklerne forbliver i kontakt med cellerne op til 72 timer (det tidspunkt, hvor de virale konstruktioner er integreret i værtscellens genom), hvilket øger sandsynligheden for virale partikler ind i cellen. For visse vanskelige at transducere celler, kan transduktioner gentages på hinanden følgende dage for at øge transduktionseffektivitet. For eksempel cellerne på dag 1 transducere, tillader cellerne at hvile på dag 2, og derefter transduktion af cellerne igen på dag 3. Det er vigtigt at vente 72 timer efter den sidste transduktionen før begyndelsen udvælgelse yderligere eksperimenter eller karakterisering af målcellerne.

Effektiv viral pakning er også afhængig af størrelsen af ​​lentiviral konstruktionen, mellem 5'-og 3'-LTR regionerne. Dette afsnit af lentiviral konstruktionen skal være ca 9 kb eller mindre, hvilket svarer til størrelsen af ​​det native HIV-genomet. Over 9 kb kan destigning i titer af de fremstillede pseudoviral partikler. Ny teknologi, såsom piggyBac transposonsekvenser vektorer, giver mulighed for pålidelig, stabil integration af transgener op til 100 kb via et enkelt transfektion. Denne fremgangsmåde kan anvendes til konstruktioner, der overstiger grænsen for størrelsen af lentivirale vektorer, i tilfælde hvor det er muligt at transficere målceller, og tilvejebringer den yderligere fordel ikke at kræve en viral pakning trin ^9,10.

De pseudoviral fremstillede partikler med denne protokol er infektiøse, at de kan inficere de fleste pattedyrcelletyper. De produkter, der anvendes i denne protokol, dog er tredje generation Biosafe i, at de producerer ikke-replikativt og selv-inaktiveringsbetingelser pseudoviruses. Derfor, når transduceret i målceller eller dyr, de målceller eller dyr, der ikke er smitsom. Substitution af andre lentivector plasmider, der ikke er tredje generation Biosafe er mulig, selv om ikke anbefales ud fra et biosikkerhedperspektiv. Den virale produktion protokollen og efterfølgende transduktion af målceller skal udføres under biosikkerhedsniveau 2, i henhold til NIH retningslinier ^11, og forskerne bør altid bære en laboratoriekittel og handsker ved håndtering af de virale partikler. Anvendes 293TN producentceller, bør rør af viruspartikler og engangsartikler pipetter skal bortskaffes på en passende beholder til smittefarligt. Genanvendelige pipetter og glas skal dekontamineres med blegemiddel og autoklavering for at reducere eksponeringen af ​​personalet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM High Glucose Medium	GIBCO, by Life Technologies	11995-073
293TN Cells	SBI	LV900A-1
pPACKH1	SBI	LV500A-1	For HIV-based lentivectors
pPACKF1	SBI	LV100A-1	For FIV-based lentivectors
Any Lentiviral vector	SBI	Various	cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters
Purefection	SBI	LV750A-1 LV750A-5
PEG-it	SBI	LV810A-1 LV825A-1
Global UltraRapid Titering kit	SBI	LV961A-1	Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles
TransDux	SBI	LV850A-1