Emballasje HIV-eller FIV-baserte Lentivector Expression konstruerer og transduksjon av VSV-G Pseudotyped viruspartikler

Summary

Lentiviral uttrykk vektorer er de mest effektive biler for stabilt uttrykke forskjellige effektor molekyler eller reporter konstruksjoner i å dele og ikke-delende celler hos pattedyr og hele organismer. Her tilbyr vi en protokoll om hvordan å pakke lentivector uttrykk konstruksjoner i pseudoviral partikler og til transduce målceller ved hjelp av pseudoviral partikler.

Abstract

Som med standard Plasmid vektorer, er det mulig å transfektere lentivectors i plasmidet form til celler med lav til middels effektivitet for å få forbigående uttrykk av effektorer. Emballasje lentiviral uttrykk konstruerer inn pseudoviral partikler, men lar opptil 100% transduksjon, selv med vanskelige å transfektere celler, slik som primær, stem, og differensierte celler. Videre gjør lentiviral leveransen ikke produsere de spesifikke cellulære responser som typisk assosieres med kjemiske transfections, for eksempel celledød som følge av toksisitet av transfeksjon reagens ^{1, 2.} Når transduced inn målceller, integrerer lentiviral konstruktet inn genomisk DNA og gir stabil uttrykk for den lille hårnål RNA (shRNA), cDNA, mikroRNA eller reporter gen ^{3, 4.} Målcellene stabilt uttrykker effektor molekylet kan isoleres ved hjelp av en valgbar markør som finnes i uttrykk vektor konstruere eksempel puromycin eller GFP. Etter pseudoviral partikler infisere målcellene, kan de ikke gjenskape innenfor målceller fordi de virale strukturelle genene er fraværende og de ​​lange terminale repetisjoner (liter) er designet for å være selv-inaktivere ved transduksjon ^{5, 6.}

Det er tre hovedkomponenter som er nødvendige for effektiv lentiviral emballasje ^{1, 5, 6, 7.}

1. Den lentiviral uttrykk vektor som inneholder noen av de genetiske elementer som kreves for emballasje, stabil integrering av viral uttrykket konstruere inn genomisk DNA, og uttrykk for effektor eller reporter.
2. De lentiviral emballasje plasmider som gir proteiner viktige for transkripsjon og pakking av en RNA kopi av uttrykket konstruere inn rekombinante pseudoviral partikler. Denne protokollen bruker pPACK plasmider (SBI) som koder for gag, pol, og rev fra HIV eller FIV genomet og vesikulær stomatitt virus g protein (VSV-G) for viral pels protein.
3. 293TN produsere r celler (avledet fra HEK293 celler) som uttrykker SV40 store T antigen, som er nødvendig for høyt titer lentiviral produksjon og en neomycin motstand genet, nyttig for å måtte velge cellene for vedlikehold.

En oversikt over viral produksjonen protokollen kan sees i figur 1. Viral produksjonen starter ved co-transfecting 293TN produsent celler med lentiviral uttrykk vektor og emballasje plasmider. Viruspartikler utskilles i media. Etter 48-72 timer cellekultur media er høstet. Cellular rusk blir fjernet fra cellekultur media, og de virale partikler er påskyndet av sentrifugering med PEG-it for konsentrasjon. Produserte lentiviral partiklene blir så titered og kan brukes til å transduce målceller. Detaljer om viral titering er ikke inkludert i denne protokollen, men kan finnes på:

ank "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ^8.

Denne protokollen er optimalisert ved hjelp av spesifikke produkter angitt. Andre reagenser kan erstattes, men de samme resultatene kan ikke garanteres.

Protocol

1. Transfeksjon av 293TN Celler med Emballasje Plasmider og Expression Konstruer

1. Seed 7,0 til 8,0 x 10 ⁶ 293TN celler per 15 cm ² kultur plate i 20 ml kultur medium inneholder DMEM medium supplert med 4 mm L-glutamin, 4,5 g / l glukose, og fosterets storfe serum (10%) uten antibiotika. Grow for 18-24 timer ved 37 ° C med 5% CO _2, slik at cellen tettheten når 60-80% confluency ved transfeksjon. I noen tilfeller kan det være nødvendig å seed flere plater av celler for å oppnå en høy nok titer for transduksjon av målcellene.
2. For hver plate av celler, tilsett 1,6 ml serum-free DMEM til en autoklaveres 2 ml Eppendorff tube. Legg 45 mL pPACKH1 eller pPACKF1 og 4,5 mikrogram lentivector din konstruere til DMEM og bland med pipettering opp og ned.
3. Legg 55 mL av PureFection i samme røret. Vortex i 10 sekunder. Inkuber DMEM-Plasmid-PureFection blandingen ved romtemperatur feller 15 min.
4. Legg til DMEM-Plasmid-PureFection blanding av vevskultur plate slipp-messig og swirl forsiktig til jevnt spre hele platen. Tilbake fatet til inkubatoren og vokser ved 37 ° C med 5% CO _2.
5. Det er ikke nødvendig å endre mediene etter transfeksjon. Hvis lentivector konstruktet uttrykker et gen som koder en fluorescerende protein som GFP, sjekke cellene under et mikroskop 12-24 timer etter transfeksjon. Du bør kunne se> 90% GFP-positive celler, noe som indikerer at transfeksjon var vellykket.
6. Samle cellekultur supernatanten etter 48 og 72 timer inn i en 50 ml sterilt sentrifugerør. Dette cellekultur supernatanten inneholder nå smittsomme pseudoviral partikler. (Følg de anbefalte retningslinjene for arbeid med BSL-2 sikkerhetsklasse.) Sentrifuger ved 1500 xg i 15 min ved romtemperatur til pellet cellular rusk. Overfør viral supernatanten til et nytt rør, og sikrer ikke å forstyrre pelleten.
7. 293TN celler som har blitt brukt for viral emballasje skal avhendes i en biologiske container og skal ikke brukes for ytterligere runder med viral emballasje.

2. Konsentrasjon av Viral supernatanten

1. Tilsett 1 volum av kulde (4 ° C) PEG-it Virus Nedbør løsningen på alle 4 volumer av lentiviral partikkel-holdig supernatanten. Nedbør av lentiviral partikler fra store volumer kan oppnås med Corning 250 ml polypropylen sentrifugerør. Bland løsningen ved å snu rørene flere ganger, men gjør ikke vortex blandingen.
2. Kjøle løsningen ved 4 ° C i minst 12 timer (opp til 4 dager er akseptabelt). Ikke rist eller rotere rørene under nedkjøling trinnet.
3. Sentrifuger supernatanten / PEG-it blandingen ved 1500 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Etter sentrifugering vil lentiviral partiklene vises som en beige eller hvit pellet på bunnen av røret. Hell ut supernatant.
4. Fjern alle spor av væske ved aspirasjon, tar seg ikke å forstyrre de utfelte lentiviral partikler i pellet. Spor av residual PEG-det vil utvanne viruset (og dermed redusere titer), men vil ikke påvirke integriteten til målcellene siden PEG-det er inert og ikke giftig.
5. Resuspender og kombinerer lentiviral partiklene i 1/100 av det opprinnelige volumet ved hjelp av kaldt (4 ° C), bufret sterilt fosfat saltvann eller DMEM inneholder 25 mM HEPES buffer.
6. Delmengde inn sterile kryogene hetteglass og oppbevares ved -70 ° C til den er klar til bruk.

3. Viral Titering og Transduksjon av målceller

1. Vi anbefaler titering de lentiviral partiklene før transducing målcellene-of-interesse og beregne riktig mangfoldet av infeksjon (MOI) for målcellene for konsistens mellom eksperimenter. For viral titering, anbefaler vi å bruke HT1080 celler som en lett-å-infisere positiv kontroll linje. Pllette oppmerksom på at titering protokollen innebærer transducing HT1080 celler med en liten delmengde av lentiviral partiklene du har pakket. Når titer er kjent, kan målcellene-of-interesse også transduced med de produserte lentiviral partikler. En anbefaler titering protokollen kan finnes på: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf ^7.
2. Plate 50.000 målcellene-of-rente per brønn i en 24-brønns plate i cellekultur media. Bruk media at cellene normalt dyrket i. dyrke cellene natten på sine angitte kultur forhold. Cellene skal være mellom 50 til 70% konfluent den dagen transduksjon.
3. På dagen for transduksjon, aspirer media fra cellene. Kombiner kultur medium med TransDux til en 1 x endelig konsentrasjon (for eksempel 2,5 mL TransDux til 500 mL av kultur medium). Deretter overføre TransDux-cell kultur medium blandingen til hver brønn.
4. Pipettering riktig mengde av virus som tilsvarer den optimale MOI for målcellene i hver brønn. Hvis det optimale MOI er ukjent, anbefaler vi å prøve en rekke ulike mois (for eksempel en MOI på 1, 2 og 5 for lett å infisere vev kultur celler, og en MOI på 1, 10 og 20 for mer vanskelig å -infisere primære celler). Dersom konsentrasjonen av lentiviral partiklene ikke er kjent (som bestemmes gjennom et virus titering protokoll), kan forskjellige mengder virus forsøkes, for eksempel 1, 2 og 5 mL av virus. Virus kan forbli i kontakt med målcellene for opptil 72 timer.
5. Videre forsøk med transduced målceller-of-interesse kan påbegynnes 72 timer etter transduksjon, når viral konstruktet har integrert i vertscellen genom. Endre medium og passasjen målet celler-of-interesse i henhold til deres spesifikke behov.

4. Representative Resultater

Den starter tettheten av 293TN cellene er avgjørende for vellykket viral emballasje. 293TN cellene må være mellom 60 -80% konfluent dagen transfeksjon (figur 2). Hvis 293TN cellene er mindre enn 60% konfluent, lar dem vokse enda noen timer før du prøver transfeksjon. Hvis 293TN cellene er> 80% konfluent, bør de replated før transfeksjon.

Hvis du bruker en lentivector uttrykker GFP, bør minst 90% av de 293TN cellene fluoresce grønne 24 timer etter transfeksjon, som indikerer en vellykket transfeksjon (figur 3). Hvis mindre enn 90% av cellene er GFP-positive, ikke gå videre til neste trinn, fordi det betyr at transfeksjon ikke var vellykket, og de virale titere vil være lav. I stedet plate nye 293TN celler og starte på nytt, og pass på at 293TN cellene er i riktig celle tetthet før transfecting.

293TN celler kan trekke av vevet kultur platene 48-72 timer etter transfeksjon. Dette betyr ikke negativt påvirke produksjonen av lentiviral partikler.

Titering med HT1080 celler

Viral titere kan beregnes ved hjelp av SBI Global UltraRapid Titering kit i henhold til produsentens anvisninger. Dette systemet benytter qPCR å måle viral integrering av WPRE sekvens fra lentiviral vektoren inn HT1080 celler og sammenligner denne med en standard kurve, basert på en genomiske referanse sekvens for å måle smittsomme enheter per ml (figur 4).

Transduksjon av målceller

Hvis du bruker lentiviral partikler som uttrykker en konstitutivt aktiv GFP markør, bør GFP positive celler begynner å vises innen 12-24 timer transduksjon, dersom transduksjon reaksjonen fungerer. GFP uttrykk bør fortsette etter lentiviral konstruktet stabilt integreres inn than vertscellen genom. Hvis transducing med ulike mois bør GFP fluorescens omtrent matche MOI, hvor lave mois vise mindre GFP fluorescens og høyere fuktighet viser økt GFP fluorescens (figur 5).

Figur 1. Oversikt over viral produksjon protokollen. De lentivector og pPACK emballasje plasmider er blandet og co-tilført inn 293TN celler. Etter 48 -72 timer er viral supernatanten samlet, og viruspartikler er framskyndet med PEG-it. Etter titering de lentiviral partikler, kan de brukes til å transduce målet celler-of-interesse. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Fase kontrastrikt bilde av 293TN celler. Cell density skal være mellom 60-80% konfluent dag transfeksjon.

Figur 3. Fluoriserende bilde av GFP-positive 293TN celler 24 timer etter transfeksjon med Purefection, pPACKH1, og en lentivector konstruksjon koding GFP.

Figur 4. WPRE qPCR resultater og standardkurve innhentet ved hjelp av SBI Global UltraRapid Titering kit å beregne MOI og tilsvarende titer av pakket viruspartikler.

Figur 5. Fluorescent bilder av HT1080 celler transduced med økende mengder lentivirus. Bildene er fra 72 timer etter transduksjon.

Discussion

Dette viral emballasje og transduksjon av målcellene protokollen er optimalisert for bruk med SBI sin viral emballasje reagenser. Bytte av andre reagenser kan påvirke utfallet av protokollen. Denne protokollen har bare blitt optimalisert for lentiviral produksjon og kan ikke være egnet for produksjon av andre typer virus eller pseudoviruses.

Vellykket viral emballasje er avhengig av flere viktige skritt. De 293TN cellene uttrykker SV40 store T antigen, som er absolutt nødvendig for utskillelse av lentiviral partiklene inn i cellekultur supernatanten. Tettheten på hvor 293TN cellene er på tidspunktet for transfeksjon er spesielt viktig for at PureFection reagens til tilstrekkelig overføre lentivector og emballasje plasmider inn i cellene. Legge til PureFection blandingen til vevskultur plate i en drop-klok måte fulgt av grundig virvlende platen er viktig for spredning av emballasje plasmiderog lentivector konstruere gjennom alle cellene. Unnlatelse av å hensiktsmessig distribuere vektorene kan resultere i utilstrekkelig lentiviral partikler blir produsert. Viral emballasje reaksjonen kan skaleres opp for produksjon av høy titer virus, basert på arealet av vevet kultur platene. Man kan velge å plate flere vevskulturstudier retter av 293TN celler per konstruksjon som må pakkes. Konsentrasjon av de virale supernatants er spesielt nyttig i å skape høy-titer virus. Viral supernatanten fra flere plater av celler kan kombineres og konsentrert til bruk i in vivo eksperimenter, eller for celler som er vanskelige å transduce.

Titering de produserte lentiviral partiklene er viktig for beregning av en nøyaktig MOI å bruke for transduksjon av målcellene. Knowing MOI som ble brukt i en gitt transduksjon gjør feilsøking i tilfelle at transduksjon er ikke vellykket. For eksempel bruker en MOI som erfor lav, kan resultere i svært få målceller uttrykker konstruksjon-of-interesse. Bruke en MOI som er for høy, men kan resultere i målceller som viser tegn på stress. Målet er å bruke en MOI som maksimerer uttrykk for konstruksjon-of-interesse og samtidig bevare helsen til cellene. Selv om vi anbefaler en qPCR-basert titering protokoll som måler integrerte eksemplarer av lentiviral konstruktet i HT1080 celler, kan andre titering tilnærminger også brukes, slik som p24 ELISA eller estimering av prosent av GFP-positive celler.

Vellykket transduksjon av målcellene er også avhengig av flere viktige faktorer. TransDux er en unik infeksjon reagens som gir høy transduksjon effektivitet, men det er ikke giftig for cellene. TransDux kan brukes i stedet for polybrene, som ofte er giftig for målcellene. Inkludering av TransDux i transduksjon av målcellene bidrar til å nøytralisere kostnader på viruspartikler og lar viruset inn i cellens. Siden TransDux er ikke giftig for cellene, kan man la lentiviral partiklene til å forbli i kontakt med cellene i opptil 72 timer (det tidspunkt de virale constructs har integrert i vertscellen genomet), og dermed øke sannsynligheten for viruspartikler inn i cellen. For noen er vanskelig å transduce celler, kan transductions gjentas på påfølgende dager for å øke transduksjon effektivitet. For eksempel, transduce cellene i dag en, la cellene hvile på dag 2, og deretter transduce cellene igjen på dag tre. Det er viktig å vente 72 timer etter siste transduksjon før begynnelsen utvalg, ytterligere eksperimenter eller karakterisering av målcellene.

Effektiv viral emballasje er også avhengig av størrelsen på lentiviral konstruere, mellom 5 'og 3'LTR regioner. Denne delen av lentiviral konstruksjonen bør være ca 9 kb eller mindre, noe som tilsvarer størrelsen på de innfødte HIV genomet. Overskridelse 9 kb kan deskrukk titer av de produserte pseudoviral partikler. Ny teknologi, for eksempel piggyBac transposon vektorer, tillate for pålitelig, stabil integrering av transgener opptil 100 kb gjennom en enkelt transfeksjon. Denne tilnærmingen kan brukes til konstruksjoner som overstiger størrelsen grensen for lentiviral vektorer, i tilfeller der det er mulig å transfektere målceller, og gir den ekstra fordelen av ikke krever en viral emballasje steg ^9,10.

De pseudoviral partikler produsert ved hjelp av denne protokollen er smittsom i at de kan infisere mest pattedyr celletyper. Produktene som brukes i denne protokollen, men er tredje generasjons biosafe i at de produserer ikke-replicative og selv-inaktivere pseudoviruses. Derfor, når transduced inn målcellene eller dyr, målcellene eller dyr ikke er smittsom eller smittsom. Bytte av andre lentivector plasmider som ikke er tredje generasjons biosafe er mulig men ikke anbefalt fra en biosikkerhetperspektiv. Den viral produksjon protokollen og påfølgende transduksjon av målcellene bør utføres under biosikkerhetsnivå 2, ifølge NIH retningslinjer ^11, og forskerne bør alltid ha en lab frakk og hansker ved håndtering av viruspartikler. Brukte 293TN produsent celler, bør rør av viruspartikler og disponibel pipetter kastes i en egnet beholder biohazard. Gjenbrukbare pipetter og glass skal dekontamineres med blekemiddel og autoklavering for å redusere eksponeringen av personell.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM High Glucose Medium	GIBCO, by Life Technologies	11995-073
293TN Cells	SBI	LV900A-1
pPACKH1	SBI	LV500A-1	For HIV-based lentivectors
pPACKF1	SBI	LV100A-1	For FIV-based lentivectors
Any Lentiviral vector	SBI	Various	cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters
Purefection	SBI	LV750A-1 LV750A-5
PEG-it	SBI	LV810A-1 LV825A-1
Global UltraRapid Titering kit	SBI	LV961A-1	Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles
TransDux	SBI	LV850A-1