Summary
ناقلات التعبير Lentiviral هي الوسائل الأكثر فعالية للتعبير عن جزيئات ستابلي المستجيب مختلفة أو يبني صحافي في تقسيم وغير تقسيم خلايا الثدييات والكائنات كلها. هنا نقدم بروتوكول بشأن كيفية حزم بنيات التعبير lentivector في جزيئات pseudoviral وtransduce الخلايا المستهدفة باستخدام جزيئات pseudoviral.
Protocol
1. ترنسفكأيشن من الخلايا 293TN مع البلازميدات تغليف والتعبير وتعبيد
- البذور 7،0-8،0 × 10 6 293TN الخلايا بنسبة 15 سم لوحة ثقافة 2 في 20 مل من ثقافة المتوسط تحتوي على DMEM المتوسطة تستكمل مع 4 مم L-الجلوتامين، 4.5 الجلوكوز غرام / لتر، ومصل بقري جنيني (10٪) من دون مضادات حيوية. تنمو ل18-24 ساعة على 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 بحيث تصل كثافة الخلية 60-80٪ confluency في وقت ترنسفكأيشن. في بعض الحالات، قد يكون من الضروري لوحات البذور عدة من الخلايا للحصول على عيار مرتفع بما يكفي لتنبيغ من الخلايا المستهدفة.
- لكل لوحة من الخلايا، إضافة 1.6 مل مصل خالية DMEM إلى مشبع 2 أنبوب Eppendorff مل. إضافة 45 ميكرولتر pPACKH1 أو pPACKF1 و 4.5 ميكروغرام من lentivector الخاص بناء على DMEM ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
- إضافة 55 ميكرولتر من PureFection في الأنبوب نفسه. دوامة لمدة 10 ثانية. احتضان-البلازميد-PureFection DMEM خليط و في درجة حرارة الغرفةأو 15 دقيقة.
- إضافة-البلازميد-PureFection DMEM خليط للأنسجة لوحة ثقافة الإفلات من الحكمة وعباب بلطف لتفريق بالتساوي في جميع أنحاء لوحة. إعادة الإناء إلى الحاضنة وتنمو في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- ليست هناك حاجة لتغيير وسائل الاعلام بعد ترنسفكأيشن. إذا التصور الخاص lentivector يعبر عن الجينات ترميز بروتين فلوري مثل GFP، والتحقق من الخلايا تحت المجهر 12-24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. يجب أن تكون قادرا على رؤية> الخلايا 90٪ GFP إيجابية، مشيرا إلى أن ترنسفكأيشن كانت ناجحة.
- جمع طاف ثقافة الخلية بعد 48 و 72 ساعة في أنبوب 50 مل الطرد المركزي عقيم. هذا طاف ثقافة الخلية تحتوي على جزيئات الآن pseudoviral المعدية. (اتبع المبادئ التوجيهية الموصى بها للعمل مع فئة سلامة BSL-2). جهاز طرد مركزي في 1500 XG لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتكوير الحطام الخلوية. نقل طاف الفيروسية لأنبوب جديد، وضمان عدم تعكير صفو بيليه.
- يجب التخلص من الخلايا 293TN التي تم استخدامها لتعبئة الفيروسية في وعاء واقية ليست لاستخدامها في جولات أخرى من التعبئة والتغليف الفيروسية.
2. تركيز طاف الفيروسية
- إضافة 1 حجم الباردة (4 ° C) الأمطار فيروس الربط بين هذا الحل إلى كل وحدات التخزين 4 من طاف الجسيمات المحتوية على lentiviral. لا يمكن أن يتحقق ترسيب الجسيمات lentiviral من كميات كبيرة مع 250 مل كورنينج أنابيب الطرد المركزي البولي بروبلين. خلط الحل من قبل مرات عدة أنابيب قلب، ولكن لا دوامة الخليط.
- بردت الحل في 4 درجة مئوية لمدة لا تقل مدة 12 ساعة (تصل إلى 4 أيام غير مقبول). لا تهز أو تدوير الأنابيب خلال الخطوة التبريد.
- منبذة طاف / الربط بين هذا الخليط في 1500 XG لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، فإن الجسيمات lentiviral تبدو وكأنها البيج أو بيليه الأبيض في الجزء السفلي من الأنبوب. من اجل الخروج من supernataNT.
- إزالة كل آثار السائل بواسطة طموح، مع الحرص على عدم تعكير صفو الجسيمات المترسبة في lentiviral بيليه. آثار متبقية الربط بين أنه سوف يخفف من فيروس (مما يقلل من عيار) ولكن لن تؤثر على سلامة الخلايا المستهدفة منذ الربط بين هذا خاملة وغير سامة.
- مخزنة فوسفات معقم Resuspend والجمع بين الجسيمات lentiviral في 100/1 من حجم الأصلي باستخدام الباردة (4 درجة مئوية)، المالحة أو التي تحتوي على 25 DMEM العازلة HEPES ملي.
- قسامة في قوارير معقمة والمبردة في مخزن -70 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
3. الفيروسية Titering وتنبيغ من الخلايا المستهدفة
- نوصي titering الجزيئات lentiviral قبل transducing الهدف الخلايا في المصالح واحتساب تعدد المناسب للعدوى (وزارة الداخلية) للحصول على الخلايا المستهدفة من أجل التناسق بين التجارب. لtitering الفيروسية، ونحن نوصي باستخدام خلايا HT1080 باعتبارها خط السيطرة سهلة لنقل العدوى الإيجابية. ررتخفيف لاحظ أن البروتوكول يتضمن titering transducing HT1080 الخلايا مع قسامة صغيرة من جزيئات lentiviral قمت تعبئتها. مرة واحدة هو معروف عيار، لا يمكن للخلايا الهدف من المصالح أيضا أن transduced مع الجسيمات lentiviral المنتجة. ويمكن الاطلاع على بروتوكول titering يوصي في: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7.
- لوحة الهدف 50000 الخلايا من المصالح لكل بئر في لوحة 24-جيدا في وسائل الإعلام ثقافة الخلية. استخدام وسائل الإعلام التي يتم زرعها عادة الخلايا تنمو فيها الخلايا بين عشية وضحاها في ظروفها ثقافة محددة. يجب أن تكون الخلايا ما بين 50 الى 70٪ متكدسة في يوم تنبيغ.
- في يوم تنبيغ، نضح في وسائل الاعلام من الخلايا. الجمع بين الثقافة المتوسطة مع TransDux إلى تركيز × 1 النهائي (على سبيل المثال، 2.5 TransDux ميكروليتر إلى 500 ميكروليتر من ثقافة المتوسط). ثم نقل TransDux-CE ليرة لبنانية خليط ثقافة المتوسط إلى كل بئر.
- ماصة حجم مناسب للفيروس والتي تتطابق مع الأمثل وزارة الداخلية للحصول على الخلايا المستهدفة في كل بئر. إذا وزارة الداخلية الأمثل هو غير معروف، من المستحسن محاولة مجموعة من موييس مختلفة (مثل وزارة الداخلية من 2، 1 و 5 لسهل تصيب الخلايا زراعة الأنسجة، وزارة الداخلية من 10، 1 و 20 للحصول على مزيد يصعب ، تصيب الخلايا الأولية). إذا لم يعرف تركيز الجسيمات lentiviral (كما هو محدد من خلال فيروس بروتوكول titering)، يمكن أن يحاكم أحجام مختلفة من الفيروس، مثل ميكرولتر 1 و 2 و 5 من الفيروس. يمكن للفيروس البقاء على اتصال مع الخلايا المستهدفة لمدة تصل إلى 72 ساعة.
- transduced المزيد من التجارب مع الخلايا في المصالح الهدف قد بدأ بعد 72 ساعة تنبيغ، مرة واحدة في التركيبة الفيروسية ودمجها في جينوم الخلية المضيفة. تغيير على المديين المتوسط ومرور الهدف الخلايا في المصالح وفقا لاحتياجاتها الخاصة.
4. ممثل النتائج
الطبقة = "jove_step"> ترنسفكأيشن من الخلايا 293TN
كثافة بدءا من الخلايا 293TN هو أمر حاسم لنجاح التعبئة والتغليف الفيروسية. يجب أن تكون الخلايا 293TN ما بين 60 -80٪ متكدسة يوم ترنسفكأيشن (الشكل 2). إذا كانت الخلايا 293TN أقل من 60٪ متموجة، والسماح لها أن تنمو لساعات قليلة أخرى قبل محاولة ترنسفكأيشن. إذا كانت الخلايا 293TN هي> متكدسة 80٪، ينبغي replated هم قبل ترنسفكأيشن.
إذا باستخدام GFP lentivector التعبير، وينبغي أن لا يقل عن 90٪ من الخلايا 293TN يتألق الخضراء بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن، مما يدل على نجاح ترنسفكأيشن (الشكل 3). إذا كانت أقل من 90٪ من الخلايا هي GFP إيجابية، لا تنتقل إلى الخطوة التالية، لأن هذا يدل على أن ترنسفكأيشن لم يكن ناجحا، والتتر الفيروسية ستكون منخفضة. بدلا من ذلك، لوحة خلايا 293TN جديد والبدء من جديد، والتأكد من أن الخلايا 293TN هي في كثافة الخلايا السليمة قبل transfecting.
قد خلايا 293TN سحب قبالة لوحات زراعة الأنسجة 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن. هذا لا يؤثر سلبا على انتاج جسيمات lentiviral.
Titering مع خلايا HT1080
ويمكن حساب التتر الفيروسية باستخدام الهيئة الفرعية للتنفيذ على المستوى العالمي عدة Titering UltraRapid وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. هذا النظام يستخدم لقياس qPCR التكامل الفيروسية من تسلسل WPRE من ناقلات lentiviral إلى HT1080 الخلايا ويقارن هذا إلى منحنى قياسي، على أساس تسلسل الجينوم مرجعية لقياس بدقة وحدات المعدية لكل مل (الشكل 4).
تنبيغ من الخلايا المستهدفة
إذا باستخدام الجزيئات lentiviral معربا عن علامة GFP نشط constitutively، وينبغي أن الخلايا GFP إيجابية تبدأ في الظهور في غضون 12-24 ساعة من تنبيغ، إذا كان رد فعل تنبيغ تعمل. وينبغي أن يواصل التعبير GFP بعد التصور lentiviral يدمج ثابت إلى رانه استضافة جينوم الخلية. إذا transducing مع موييس مختلفة، ينبغي أن تتطابق مع ما يقرب من مضان GFP وزارة الداخلية، حيث تظهر موييس منخفض أقل مضان GFP وارتفاع موييس تظهر زيادة GFP مضان (الشكل 5).
الشكل 1. نظرة عامة على بروتوكول الانتاج الفيروسية. تختلط البلازميدات التعبئة والتغليف وlentivector pPACK وشارك في transfected في الخلايا 293TN. بعد 48 -72 ساعة، ويتم جمع طاف الفيروسية، وعجلت الجسيمات الفيروسية مع الربط بين ذلك. بعد titering الجزيئات lentiviral، ويمكن استخدامها لtransduce الهدف الخلايا في المصالح. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الرقم المقابل المرحلة 2. صورة من الخلايا 293TN. خلية الكثافةوينبغي أن يكون من بين ذ متكدسة 60-80٪ في اليوم من ترنسفكأيشن.
الشكل 3. صورة نيون من الخلايا GFP إيجابية 293TN بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن مع Purefection، pPACKH1، وترميز التركيبة GFP lentivector.
الشكل 4. النتائج qPCR WPRE ومنحنى معيار تم الحصول عليها باستخدام الهيئة الفرعية للتنفيذ على المستوى العالمي عدة Titering UltraRapid لحساب وزارة الداخلية وعيار المقابلة من الجسيمات الفيروسية التي تم حزمها.
transduced الشكل 5. صور نيون من الخلايا HT1080 مع كميات متزايدة من الفيروسة البطيئة. الصور هي من 72 ساعة بعد تنبيغ.
Discussion
وقد تم تحسين هذه التعبئة والتغليف الفيروسية وتنبيغ من بروتوكول الخلايا المستهدفة للاستخدام مع الكواشف الهيئة الفرعية للتنفيذ في التعبئة والتغليف الفيروسية. قد استبدال الكواشف الأخرى التي تؤثر على نتائج بروتوكول. فقط وقد تم هذا البروتوكول الأمثل لإنتاج lentiviral و قد لا تكون مناسبة لإنتاج أنواع أخرى من الفيروسات أو pseudoviruses.
التعبئة والتغليف الفيروسية الناجحة تعتمد على عدة خطوات رئيسية. الخلايا 293TN تعبر عن SV40 مستضد تي كبير، وهو أمر ضروري للغاية لإفراز الجزيئات lentiviral في الخلية طاف ثقافة. كثافة في الخلايا التي هي 293TN في وقت ترنسفكأيشن أهمية خاصة من أجل أن كاشف PureFection لنقل بما فيه الكفاية lentivector والبلازميدات التعبئة والتغليف في الخلايا. واضاف ان خليط PureFection إلى الأنسجة لوحة الثقافة بطريقة الإفلات من الحكمة تليها يحوم بدقة في لوحة من المهم للتشتت البلازميدات التعبئة والتغليفوlentivector بناء في جميع الخلايا. قد فشل في توزيع مناسب للناقلات ينتج جسيمات lentiviral غير كاف يتم إنتاجها. يمكن زيادتها رد فعل التعبئة والتغليف الفيروسية تصل لإنتاج فيروس عيار عالية، وبناء على المساحة السطحية للوحات زراعة الأنسجة. ويمكن للمرء أن يختار لعدة أطباق لوحة زراعة الأنسجة من خلايا 293TN في التصور الذي يجب تعبئتها. تركيز supernatants الفيروسية مفيد بشكل خاص في خلق رفيع عيار الفيروس. ويمكن الجمع بين طاف الفيروسية من لوحات متعددة من الخلايا والتي ركزت في لاستخدامها في التجارب المجراة، أو للخلايا التي يصعب transduce.
Titering الجزيئات تنتج lentiviral المهم لحساب دقيق وزارة الداخلية لاستخدامها لتنبيغ من الخلايا المستهدفة. معرفة وزارة الداخلية التي تم استخدامها في تنبيغ نظرا تمكن مخرج في حال أن تنبيغ غير الناجحة. على سبيل المثال، باستخدام وزارة الداخلية التي هيقد منخفضة للغاية تؤدي إلى الخلايا المستهدفة عدد قليل جدا من التعبير عن التصور في المصالح. تستخدم وزارة الداخلية التي هي عالية جدا، ومع ذلك، قد يؤدي إلى الخلايا المستهدفة التي تظهر علامات الإجهاد. والهدف من ذلك هو استخدام وزارة الداخلية والتي تزيد التعبير عن التصور، من المصلحة مع الحفاظ على صحة الخلايا. في حين أننا نقترح على بروتوكول titering qPCR مقرها الذي يقيس نسخا متكاملة من التركيبة lentiviral HT1080 في الخلايا، ويمكن أيضا النهج titering أخرى يمكن استخدامها، مثل ELISA P24 أو تقدير في المئة من GFP إيجابية الخلايا.
تنبيغ ناجح من الخلايا المستهدفة هي أيضا تعتمد على عدة عوامل رئيسية. TransDux هو كاشف عدوى فريدة من نوعها التي تمكن الكفاءات تنبيغ عالية، ولكن ليست سامة للخلايا. ويمكن استخدام TransDux بدلا من polybrene، التي غالبا ما تكون سامة للخلايا المستهدفة. إدراج TransDux في تنبيغ من الخلايا المستهدفة تساعد على إزالة الرسوم على الجسيمات الفيروسية، وتتيح للفيروس في الخليةق. منذ TransDux ليست سامة للخلايا، يمكن للمرء أن يسمح للجزيئات lentiviral أن يبقى على اتصال مع هذه الخلايا لمدة تصل إلى 72 ساعة (في الوقت الذي يبني الفيروسية ودمجها في جينوم الخلية المضيفة)، وبالتالي زيادة احتمال لل الجسيمات الفيروسية دخول الخلية. بالنسبة لبعض الخلايا التي يصعب transduce، ويمكن تكرار transductions في أيام متتالية لتعزيز كفاءة تنبيغ. على سبيل المثال، transduce الخلايا في اليوم 1، تسمح للخلايا للراحة في يوم 2، وtransduce ثم الخلايا مرة أخرى في اليوم 3. من المهم أن ننتظر 72 ساعة بعد وتنبيغ الأخيرة قبل اختيار بداية، تجارب أخرى أو توصيف الخلايا المستهدفة.
التعبئة والتغليف فيروسي فعال يعتمد أيضا على حجم التركيبة lentiviral، بين '(5)، والمناطق 3'LTR. يجب أن هذا الجزء من التركيبة lentiviral يكون ما يقرب من 9 كيلو بايت أو أقل، وهو ما يعادل حجم الجينوم فيروس نقص المناعة البشرية الوطنية. تتجاوز 9 كيلوبايت مايو ديتجعيده عيار الجسيمات pseudoviral المنتجة. التكنولوجيا الجديدة، مثل ناقلات ينقول piggyBac، والسماح للتكامل وموثوق بها مستقرة من الجينات المحورة تصل إلى 100 كيلوبايت من خلال ترنسفكأيشن واحد. ويمكن استخدام هذا النهج لبنى التي تتجاوز الحد الأقصى لحجم لناقلات lentiviral، في الحالات التي من الممكن أن transfect الخلايا المستهدفة، ويوفر ميزة إضافية لا تتطلب خطوة التعبئة والتغليف 9،10 الفيروسية.
الجزيئات pseudoviral المنتجة باستخدام هذا البروتوكول هي المعدية وذلك لأنها يمكن أن تصيب معظم أنواع الخلايا الثديية. المنتجات المستخدمة في هذا البروتوكول، ولكن الجيل الثالث من biosafe في أنها تنتج غير قابلة للتكرار وpseudoviruses الذاتي تعطيل. ولذلك، transduced مرة واحدة في الخلايا المستهدفة أو الحيوانات، والخلايا المستهدفة أو الحيوانات ليست وبائية أو معدية. استبدال البلازميدات lentivector الأخرى التي ليست من الجيل الثالث biosafe ممكن على الرغم من أن لا ينصح من سلامة الأحيائيةمنظور. وينبغي تنفيذ بروتوكول الانتاج الفيروسية وتنبيغ اللاحقة من الخلايا المستهدفة تحت مستوى السلامة الأحيائية 2، وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة 11، والباحثين وينبغي دائما ارتداء معطف مختبر وقفازات عند التعامل مع الجسيمات الفيروسية. استخدام الخلايا المنتجة 293TN، ينبغي التخلص منها أنابيب من الجسيمات الفيروسية، وماصات القابل للصرف في حاوية 1 اقية مناسبة. وينبغي تطهير الماصات قابلة لإعادة الاستخدام والأواني الزجاجية مع التبييض وجهاز الأوتوكليف لتقليل التعرض للأفراد.
Disclosures
وترعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المقالة الفيديو عن طريق نظام العلوم البيولوجية.
Acknowledgments
نود أن نعترف الموظفين والعلماء في الهيئة على دعمهم في تطوير واختبار هذه البروتوكولات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11995-073 | |
| 293TN Cells | SBI | LV900A-1 | |
| pPACKH1 | SBI | LV500A-1 | For HIV-based lentivectors |
| pPACKF1 | SBI | LV100A-1 | For FIV-based lentivectors |
| Any Lentiviral vector | SBI | Various | cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters |
| Purefection | SBI | LV750A-1 LV750A-5 | |
| PEG-it | SBI | LV810A-1 LV825A-1 | |
| Global UltraRapid Titering kit | SBI | LV961A-1 | Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles |
| TransDux | SBI | LV850A-1 |
References
- RNA Viruses. A Practical Approach. Cann, A. J. , Oxford Univ. Press. (2000).
- Gould, D. J., Favorov, P. Vectors for the treatment of autoimmune diseases. Gene Therapy. 10, 912-927 (2003).
- Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
- Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Dull, T., Zufferey, R. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Federico, M. Lentivirus Gene Engineering Protocols. , Humana Press. New Jersey. (2003).
- Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors. Mol. Ther. 1, 31-38 (2000).
- Manual Titer Kit. , Available from: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf (2011).
- Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L. Jr, Wilson, M. H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343-1348 (2010).
- Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Mol. Cell Biochem. , (2011).
- NIH Office of Biotechnology Activities. Guidance on Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors. , Available from: http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf (2011).
