En metod för att förbereda translationally aktiv, intakt synaptoneurosomes (SNS) från mus hjärnbarken beskrivs. Metoden använder en diskontinuerlig Percoll-sackaros densitetsgradient möjliggör en snabb beredning av aktiva SNS.
Synaptoneurosomes (SNS) erhålls efter homogenisering och fraktionering av musen hjärnbarken. De är återförslutas blåsor eller isolerade terminaler bryta sig loss från axon terminaler när kortikala vävnad homogeniserad. SNS behålla pre-och postsynaptiska egenskaper, vilket gör dem användbara i studiet av synaptisk transmission. De behåller de molekylära maskiner som används i neuronala signalering och kan upptag, lagring och frisättning av signalsubstanser.
Produktionen och isolering av aktiva SNS kan vara problematiskt att använda medier som Ficoll, som kan vara cytotoxiska och kräva förlängd centrifugering på grund av hög densitet, och filtrering och metoder centrifugering, vilket kan resultera i låg aktivitet på grund av mekaniska skador på SNS. Ger dock användning av diskontinuerliga Percoll-sackaros densitetsgradienter att isolera SNS en snabb metod för att producera bra skördar av translationally aktiva SNS. Den Percoll-sackaros gradientmetoden är snabb och skonsam som sysselsätter isoton förhållanden, har färre och kortare centrifugering snurrar och undviker centrifugering steg som pellets SNS och orsaka mekaniska skador.
Det diskontinuerliga Percoll-sackaros gradient förberedelser som beskrivs häri är en snabb, tillförlitlig metod att isolera aktiva SNS, som kan användas i en mängd olika synaptisk transmission experiment. Denna gradient metod, som bygger på den metod som utvecklats av Dunkley et al., 3,4 är en subcellulära hjärna fraktionering förfarande som isolerar både pre-och postsynaptiska membran som härrör blåsor som är kopplade till varandra. Utan ytterligare rening dessa SNS är kompatibla med en män…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka BK augusti från University of Wisconsin-Madison Electron Microscope mikrokreditinstrumentet för elektronmikroskop. Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01-DA026067 och P30-HD03352 (till JSM).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
CO2 gas | Airgas (UW-MDS) | CD 50 | |
EDTA | RPI | E57020 | |
EtOH | Fisher | A407SK-4 | |
HCl | Fisher | A142-212 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
KH2PO4 | Fisher | P285-500 | |
PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit | Pierce | 89888 | |
NaCl | RPI | S23020 | |
NaHCO3 | Fisher | BP328-500 | |
Na2PHO4 | Fisher | S381-500 | |
Sucrose | RPI | S24060 | |
Tris Base | RPI | T60040 | |
Tetrodotoxin | Sigma | T5651 | |
Express Pro Label Mix S35 Easy Tag | Perkin Elmer | NEG772 | |
Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Dissection tools | |||
Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled ” A” and “B”) | Wheaton | ||
P1000 Gilson Pipetman | Gilson | F123602 | |
Allegra 6KR Centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | |
GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 360581 | |
Beckman J2-21 Centrifuge | Beckman | ||
Beckman tubes with caps | Beckman | 355672 | |
White walled adapters | Beckman | 342327 | |
Blue walled adapters | Beckman | ||
JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor | Beckman | 369691 |
Table of antibodies used for western blots:
Name of Antibody | Company | Catalogue number | Host Species | Dilution Factor |
---|---|---|---|---|
β-Actin | Sigma | A5441 | mouse | 1:2000 |
GFAP | Santa Cruz | sc-65343 | mouse | 1:200 |
GP73 | Santa Cruz | Sc-134509 | rabbit | 1:200 |
HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | mouse | 1:200 |
Laminβ | Santa Cruz | Sc-6261 | goat | 1:200 |
Prohibitin | Santa Cruz | sc-28259 | rabbit | 1:200 |
PSD95 | Millipore | MAB1596 | mouse | 5 μg/μL |
SNAP25 | AbCam | ab5666-100 | rabbit | 1:2000 |
Synaptophysin | Millipore | MAB368 | mouse | 1:500 |
β-3-Tubulin | Santa Cruz | sc-80016 | mouse | 1:200 |