Summary
Detta är en metod för att visualisera leukocyt vidhäftning till endotelet i skördade trycksatta kärl. Tekniken gör det möjligt att studera vaskulär vidhäftning under skjuvning flöde med olika intraluminal tryck upp till 200 mmHg därmed efterliknar-ning de patofysiologiska förhållanden av högt blodtryck.
Abstract
Worldwide, hypertoni rapporteras vara i cirka en fjärdedel av befolkningen och är den ledande biomedicinska riskfaktor för mortalitet över hela världen. I kärlsystemet hypertoni är förenat med endoteldysfunktion och ökad inflammation som leder till åderförkalkning och olika sjukdomstillstånd som kronisk njursjukdom 2, stroke 3 och hjärtsvikt 4. Ett första steg i vaskulär inflammation som leder till aterogenes är vidhäftning kaskad som involverar den rullande, tjudra, följsamhet och efterföljande transmigration av leukocyter genom endotelet. Rekrytering och ansamling av leukocyter till endotelet förmedlas av en uppreglering av adhesionsmolekyler som vaskulär celladhesionsmolekyl-1 (VCAM-1), intracellulära celladhesionsmolekyl-1 (ICAM-1) och E-selektin samt ökning av cytokin och kemokinreceptorantagonist utsläpp och en uppreglering av reaktiva syreradikaler 5. In vitro-metoder såsom statisk vidhäftning analyser hjälpa till att fastställa mekanismer som är involverade i cell-till-cell vidhäftning samt analys av molekyler celladhesion. Metoder som används i tidigare in vitro-studier har visat att akut ökning av trycket på endotelet kan leda till monocyter vidhäftning, en uppreglering av adhesionsmolekyler och inflammatoriska markörer 6 dock, i likhet med många in vitro-tester har dessa fynd inte utförts i realtid under fysiologiska flödesförhållanden, eller med helblod. Därför är in vivo-analyser alltmer används i djurmodeller för att visa vaskulär inflammation och plack utveckling. Intravital mikroskopi är nu allmänt används för att bedöma leukocyt vidhäftning, rullande, migration och transmigration 7-9. Vid kombination av effekterna av trycket på leukocyter till endothelial vidhäftning in vivo studier är mindre omfattande. En sådan studie undersöker realtid effekterna av flödet och sax på arteriell tillväxt och remodellering, men inflammatoriska markörer var bara bedömas genom immunohistokemi 10. Här presenterar vi en modell för inspelning leukocyt vidhäftning i realtid i intakt trycksatta blodkärl med hjälp av helblod perfusion. Metoden är en modifiering av en ex vivo fartyg kammare perfusionen modell 9 som möjliggör realtids-analys av leukocyt-endotelceller lim interaktioner i intakt fartyg. Vår modifiering möjliggör manipulation av intraluminal tryck upp till 200 mmHg möjliggör studier inte bara under fysiologiska flöde men även tryckförhållanden. Medan trycket myography system har tidigare visat att observera kärlväggen och lumendiameter 11 samt fartyg kontraktion det är första gången visar leukocyt-endotel interaktioner i realtid. Här har vi demonstrera tekniken med hjälp av halspulsåder skördas från råttor och kanylerade till en skräddarsydd flöde kammare kopplad till ett fluorescerande mikroskop. Fartyget kammaren är utrustat med en stor botten coverglass gör en stor linsdiameter mål med kort arbetstid avstånd till bilden fartyget. Dessutom kan väljas agonist och / eller antagonister utnyttjas för att ytterligare undersöka de mekanismer som styr cellens vidhäftning. Fördelarna med denna metod under intravital mikroskopi inkluderar ingen inblandning av invasiv kirurgi och därmed en högre genomströmning kan erhållas. Metoden möjliggör också användningen av lokaliserad hämmare till önskad fartyget medan intravital bara möjligt för systemisk hämmare.
Protocol
1. Isolera halspulsåder
- Euthanase10 vecka gammal Sprague Dawley via CO 2 / O 2 kvävning.
- Punktskatter vänster och höger gemensamma halspulsåder med aorta och hjärta att se minimal sträckning av fartygen.
- I iskall Krebs buffert separera halspulsåder från kroppspulsådern och hjärtat och utföra nära dissekering.
- Håll isolerade fartyg i Krebs på isen före montering.
Ca. tid = 45 minuter
2. Priming fartyget kammaren
- Vid proximala och distala kontakter av fartyget kammaren spola Krebs buffert kvar vid fysiologiskt pH genom att ingjuta carbogen gas (95% O 2, 5% CO 2) genom bufferten vid 37 ° C.
- Se till att slangar och kanyler spolas helt och är i linje.
- Skölj Krebs buffert via P1 (proximal) och P2 (distala) givare. Stäng kranarna för att se några luftbubblor i givare.
- Anslut givarna till motsvarande kontakter och återigen spola mer Krebs buffert garanterar inga luftbubblor. Stänga kranarna till kammaren.
Ca. tid = 15 minuter
3. Trycksättning fartyget kammaren
- Slå på tryckbärande anordningar: tryck servo, tryckvakt, peristaltiska pump (figur 1).
- Med den peristaltiska pumpen på trycket och trycket servo på automatisk köra Krebs buffert genom slangen vid 20 mmHg (ringa vid 1), vilket garanterar inga luftbubblor.
- Anslut slangen till den stängda P2 givaren. Trycket kommer att bli stabil.
- Öppna P2 peka på fartyget kammaren att spola ut eventuella bubblor stäng sedan av.
- Fyll badkaret med Krebs buffert (5 - 7 ml).
Ca. tid = 10 minuter
4. Montering av fartyget
- Enligt en dissekera mikroskop plats svart polyester band på varje kanyl (Figur 2).
- Flytta kanyler och hållare kanyl isär och montera ¼ fartyg (aortabågen slutet) på P1 kanylen. Se till att inte riva fartyget.
- Hjälp av en spruta fylld med Krebs buffert försiktigt spola överflödigt blod ut från fartyget via P1 givare. Stänga P1 till kammaren.
- Säkra fartyget till P1 kanylen med polyester slips.
- Flytta kanyler / hållare kanyl närmare för montering på P2 kanylen.
- Mount distala änden av fartyget (~ ¼ av längden) på distala kanyl. Säkert med polyester slips.
Ca. tid = 20 min
5. Trycksättning fartyget
- Justera kanylen innehavarna att säkerställa att inget böja eller sträcka i fartyget.
- Med P1 och P2 stängd för kammaren byta trycket servo från automatisk till manuell. Kolla på trycket servo finns det ingen kontinuerlig minskning av trycket inom 10 sekunder. Om det finns, finns en läcka uppstår och anslutningar och givare måste säkras på plats.
- Justera trycket servo tillbaka till automatiskt öppna P2 till kammaren. Under mikroskop observerar fartyget vidgas när kranen öppnas till kammaren.
- Växla trycket servo till manuell. Återigen kontrollera för kontinuerlig minskning av trycket inom 10 sekunder. Om det finns en läcka då systemet inte är trycket hårt och det är sannolikt att ett hål i fartyget.
- Byt tillbaka till automatiskt öppna P1 kammaren. På den manuella inställningen kontrollera att trycket är fortsatt stabil.
- Om inget läckage, om manuell inställning ökar ratten 2 (40 mmHg).
- Anpassa automatisk och observera fartyget under mikroskop. Om nödvändigt, justera kanylen innehavaren att säkerställa att inget böja i vessel.Check för läckor på manuell inställning.
- Upprepa steg från 5,6 till 5,7 öka ratten 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) och så vidare tills önskat tryck har uppnåtts.
Ca. tid = 15 - 30 minuter
6. Inkubering av trycksatta kärl
- Anslut den inställda temperaturen regulatorn till 37 ° C.
- Med en andra Slangpumpar BEGJUTA Krebs buffert (1 ml / min) till kärlet kammaren badet.
- Anslut aspirator till kammaren att se endast det översta lagret av badet tas bort.
- Inkubera trycksatta kärl vid 37 ° C under 1 timme med trycket satt till automatisk.
- Kontrollera att trycket inte läcker (byta till manuell) med jämna mellanrum.
- Effekterna av olika farmakologiska interventioner kan observeras genom att helt enkelt lägga föreningen på badet under inkubationen.
Ca. tid = 1 timme
7. Perfusing den trycksatta kärl med helblod
- Under inkubation få minst 7,5 ml humant helblod / fartyg som samlats in i 40 U heparin / mL blod. Inkubera i 50 ml Falcon vid 37 ° C.
- 10 minuter före slutet av tHan inkubation etikett blod med VybrantDil (1:1000) i 10 minuter vid 37 ° C i mörker.
- Efter 10 minuter, samla in blod i en spruta clearing eventuella bubblor och fäst på en spruta pump med värme jacka inställd på 37 ° C.
- Stänga P1 givare till kammaren / fartyg och anslut sprutan och avfall slangen.
- Rensa blod vid 1000 ml / min genom avfallet slangen till avlägsna eventuella bubblor.
- Öppna P1 till kammaren. Trycket servo kommer att justeras automatiskt för att upprätthålla önskat tryck.
- BEGJUTA blod vid 100 mikroliter / min.
- Med hjälp av en fluorescerande mikroskop kopplat till en digital kamera två postfälten av perfusion fartyget under 15 sekunder vid 1, 3, 5, 7,5 och 10 minuter.
- Inlägg perfusion endotel integritet och funktion kan bedömas via farmakologiska tekniker såsom myograph och adhesionsmolekyl uttryck kan bestämmas genom immunhistokemi för att ytterligare validera det inflammatoriska svaret.
Ca. tid = 15 minuter
8. Representativa resultat:
En schematisk bild av tryckkammare installationen visas i figur 1. Med en digital kamera kopplad till ett fluorescerande mikroskop resultat kan visualiseras direkt via live video-inspelningar. Representant videobilder ses i Figur 3 där leukocyter anses vara anhängare till endotelet om de förblev stilla i 10 sekunder. Med videoinspelningar på kontinuerlig följas slinga celler kan räknas som ett genomsnitt per fält. Medan både låg (Figur 3A) och hög (Figur 3B) trycket kommer att orsaka en viss mängd av vidhäftning en betydande ökning av leukocyt vidhäftning på de högre intraluminal trycket ses och det är också visat kvantitativt (Figur 4).
Figur 1. Trycksatt ex vivo fartyget kammare schema. En kanylerade fartyg är anslutna till en proximal (P1) givaren och en distal (P2) givare som gör att blodtrycket att manipulera på fartyget. Perfusionen är genom P1 givaren och trycket upprätthålls via P2 givaren.
Figur 2. Cannuala med band. Är svart polyester band bifogas varje kanyl.
Figur 3. Representant videobilder. Dynamic cell adhesion (röd pil) under fluorescens vid 80 mmHg (A) och 120 mmHg (B) efter 10 minuters perfusion.
Figur 4. Leukocyt fäste Sprague Dawley halspulsåder efter 1 timme inkubation vid lågt (80 mmHg) och högt tryck (120 mmHg). *** P <0,001, som analyseras av 2-vägs upprepade mätningar ANOVA med Bonferroni post hoc test.
Discussion
Detta är en modifierad metod för att studera leukocyt vidhäftning till endotelet i intakt isolerade blodkärl under trycksatta förhållanden i realtid. Perfusion av fartyget kammaren ensam möjliggör en snabb validering av pro-inflammatoriska stammar av stora möss och fartyg råtta. Aktivera tryck manipulation ger dynamiska cell interaktioner skall beaktas från låg till mycket hög intraluminal tryck och därmed bättre efterliknar-ning fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Diameter av fartyg kan också mätas med hjälp av en tillräckligt cell-imaging program och därför skjuv flöde och hastighet kan bestämmas och därmed manipuleras.
Med sin myograph kapacitet, farmakologiska interventioner placeras i badet lägga till ytterligare en dimension till de experimentella förutsättningar som möjligt med denna modell möjliggör studier av mekaniska och signalsystem. Medan endotel bevarande inte kan bekräftas under tryck manipulation, kan svaren på ACh och PE ske efter perfusion 9.
Det bör noteras att denna inställning visar effekterna av intraluminal press på cell-till-cell interaktioner inte effekterna av pulserande blodflödet eller systoliskt eller diastoliskt tryck. Vidare, medan akuta tryckförändringar på leukocyt vidhäftning observerades, kan denna inställning också användas för att titta på kroniska tryck effekter (dvs. att öka inkubationstiderna och med hjälp av en kronisk modell trycket djur). Sprague Dawley gemensamma halspulsåder demonstreras i denna uppsättning upp men andra stammar och arter kan användas med lämpliga justeringar av kanylen storlek. Det är faktiskt viktigt att notera att ålder och djurens vikt påverkar fartygets storlek och därmed att ställa in måste individualiseras för varje fartyg. Stäng och noggrann dissekering av bindväv kan förbättra visualisering av leukocyter oerhört.
Disclosures
Studien Protokollet godkändes av Alfred medicinsk forskning och utbildning Precinct djuretik kommittén och Alfred Hospital etikkommittén.
Acknowledgments
Denna studie har delvis stöd i den viktorianska regeringens OIS Program, National Health och Medical Research Council of Australia program och projektbidrag (JPF Chin-damma) och UTBILDNINGSBIDRAG (D Michell).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Carl Zeiss, Inc. | SteREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| Digital Camera and Controller | Hamamatsu Corp. | C4742-95 | |
| Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
| Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS - 200 | |
| Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM - 4 | |
| 2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT - F | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
| Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |
References
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Szczech, L. A. Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension. Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.
- Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke. Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. JAMA. 275, 1557-1562 (1996).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Riou, S. High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall. Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).
- Ley, K., Gaehtgens, P. Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res. 69, 1034-1041 (1991).
- Bernhagen, J. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13, 587-596 (2007).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Eberth, J. F. Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling. J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).
- Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator. J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).
