γ-herpesvirüslerinin (γ-HVS) ev sahibi ömür boyu kalıcılığı kurmak. Enfeksiyon γ-HV68 ile farelerin genetik çözülebilir sağlar<em> In vivo</em> ΓHVs ömrü / patogenezinde karakterizasyonu modeli. Bu protokol, plak oluşturan, bulaşıcı merkezi, ve qPCR deneyleri enfeksiyonu takip eden akut ve latent aşamasında γHV68 enfeksiyon tespit ve kantitatif açıklamaktadır.
γ-herpesvirüslerinin (γ-HVS) lenfoid hücrelerde 1 latent enfeksiyonlar kurmak için yeteneklerini dikkat çekicidir. EBV ve KSHV insan olarak γ-HVS, dar ana aralığı ciddi detaylı patojenik çalışmaları engellemiştir. Murin γ-herpesvirus 68 (γHV68) hisse senetleri γ-HVS insan ve yaygın genetik ve biyolojik benzerlik murid kemirgenler 2 doğal bir patojen . Viral enfeksiyon farklı aşamalarında fareler kendilenmiş suşları γHV68 enfeksiyon gibi, değerlendirme sırasında viral yaşam döngüsü ve γ-HVS enfeksiyon patogenezinde anlamak için önemli bir model sağlar.
Intranazal aşılama üzerine, daha sonra dalak ve diğer hücrelere, ev sahibi 3,4 ömrü boyunca yeniden olabilir gizli bir enfeksiyon, akut akciğer viremi γHV68 enfeksiyonu sonuçları çözümlenir bu. Bu protokol, biz eşek plak testinin nasıl kullanılacağını anlatacağızpost-intranazal enfeksiyonu (dpi) – akciğer bulaşıcı bir virüs titresi erken evre (7 gün 5) Vero hücre mono tabakaları homojenatlarında. Akut enfeksiyon, büyük ölçüde 2 temizlenir, 3 hafta postinfection γHV68 bir latent enfeksiyon 14 dpi etrafında kurulan ve daha sonra farelerin dalak tutulur. Gizli virüs enfeksiyonu genellikle uykuda kalır ve onun gen ekspresyonu çoğu kapanır sayede enfekte dokular, hücrelerin çok küçük bir nüfus etkiler. Latent enfekte splenositlerin kendiliğinden virüs, viral gizli yükü belirlemek için bulaşıcı bir merkezi (IC) yöntemi ile değinmeyecek olabilir doku kültürü içine explanting sonra yeniden etkinleştirin. Akut ve / veya latent enfekte dokular, kantitatif real-time PCR viral genomun kopya miktarını hesaplamak için (qPCR), maksimum hassasiyet ve doğruluk için kullanılır. QPCR ve plak tahlil ve / veya IC tahlil sonuçlarının kombine analizler, viral Spatiotemporal profillerini ortaya koyacaktırin vivo çoğaltma ve enfektivite.
γHV68 yaygın insan γ-HVS 2,4,5 patogenezinde anlamak için bir model olarak kullanılmıştır. Bu protokol, farelerde intranazal aşılama sonrası γHV68 akut ve latent enfeksiyon değerlendirmek, plak için bulaşıcı bir virüs titresi tahlil, viral gizli yük için IC tahlil ve viral genomun yük için qPCR olmak üzere üç rutin olarak kullanılan yöntem tanımlanmıştır.
Plak testi, enfekte olmuş hücrelerde ya da dokularda virüs titresi belirlemek için yaygın o…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, teknik danışmanlık ve destek Ren Sun (University of California, Los Angeles) ve Seungmin Hwang (Washington Üniversitesi) kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Baxter Vakfı, Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (C. Liang R01 CA140964 ve R21 AI083841) tarafından finanse edildi.
Material Name | Preparation Procedure |
Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment