Summary

Måling af γHV68 infektion i Mus

Published: November 22, 2011
doi:

Summary

γ-herpesvirus (γ-HVS) etablere livslang persistens i deres vært. Infektion af mus med γ-HV68 giver en genetisk medgørlige<em> In vivo</em> Model til karakterisering af de livscyklus / patogenesen af ​​γHVs. Denne protokol beskriver påvisning og kvantificering af γHV68 infektion ved akutte og latente følger efter infektion af plak-dannende, smitsomme centrum, og qPCR assays.

Abstract

γ-herpesvirus (γ-HVS) er kendt for deres evne til at etablere latente infektioner af lymfoide celler 1. Den snævre værtsspektrum af menneskelige γ-HVS, såsom EBV og KSHV, har alvorligt hindret detaljerede sygdomsfremkaldende studier. Murine γ-herpesvirus 68 (γHV68) aktier omfattende genetiske og biologiske ligheder med den menneskelige γ-HVS og er en naturlig patogen af murid gnavere 2. Som sådan evaluering af γHV68 infektion af mus indavlede stammer på forskellige stadier af virusinfektion giver en vigtig model for forståelse viral livscyklus og patogenese ved γ-HVS infektion.

Efter intranasal inokulering at γHV68 infektion resulterer i akutte viræmi i lungen er senere løst i en latent infektion i splenocytes og andre celler, som kan blive genaktiveret i hele livet i værtslandet 3,4. I denne protokol, vil vi beskrive, hvordan du bruger plaque assay at vurderes infektiøse virus titer i lungen homogenater på Vero-celle monolag i det tidlige stadium (5 – 7 dage) af post-intranasal infektion (dpi). Mens akut infektion stort set er ryddet 2 – 3 uger postinfection, en latent infektion af γHV68 er etableret omkring 14 dpi og vedligeholdes senere i milten af ​​mus. Latent infektion normalt påvirker en meget lille population af celler i det inficerede væv, hvor virus forbliver sovende og slukker de fleste af sine genekspression. Latent-smittede splenocytes spontant reaktivere virus ved eksplantation i vævskultur, der kan gentages af en smitsom center (IC) assay for at bestemme den virale latente belastning. For yderligere at vurdere mængden af ​​virale genom kopier i akut og / eller latent inficeret væv, kvantitativ real-time PCR (qPCR) bruges til dens maksimale følsomhed og nøjagtighed. Den kombinerede analyser af resultaterne af qPCR og plaque assay, og / eller IC-analysen vil afsløre Spatiotemporal profiler af viralreplikation og smitteevne in vivo.

Protocol

Følgende protokol vil beskrive studiet af virus titre og virale genom belastninger i lytiske og latent infektion cyklus af γHV68 i mus, som kan teorien anvendes til at vurdere infektion med andre virus deler samme livsstil, til den, γHV68. 1. Forstærkning af γHV68 Tø en frossen hætteglas med γHV68 i 37 ° C vandbad. Tilføj viral inoculums til NIH3T12 eller 3T3 cellekultur (~ 50% confluency) i 10 cm tallerkener og kultur de inficerede celler ved 37 ° C i 5% CO <…

Discussion

γHV68 har været meget anvendt som model for at forstå patogenesen af menneskelige γ-HVS 2,4,5. I denne protokol, beskrev vi tre rutinemæssigt anvendte metoder, herunder plaque assay for smittefarlige virus titer, IC assay for viral latente belastning, og qPCR for virale genom belastning, til at vurdere akutte og latent infektion af γHV68 efter intranasal podning hos mus.

Den plaque assay er blevet brugt i udstrakt grad til at bestemme virus titer i de inficerede celler eller…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne anerkende teknisk rådgivning og støtte fra Ren Solen (University of California, Los Angeles) og Seungmin Hwang (Washington University). Dette arbejde blev finansieret af Baxter Foundation, National Institutes of Health tilskud (R01 CA140964 og R21 AI083841 til C. Liang).

Materials

Material Name Preparation Procedure
Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay
  1. Heat ~ 250 ml of distilled water in TC bottle to > 80°C (boiling for 3 min in microwave)
  2. Add gradually 2.5 g MC powder into heated water, stirring over low heat until dissolved.
  3. Autoclave immediately for 15 min at liquid cycle.
  4. Stirring the autoclaved MC media at 4°C overnight.
  5. Combine 250 ml MC media with 200ml 2 x MEM (Gibco-BRL) + 50 ml FBS to give 500 ml overlay media.
Fix/stain medium for plaque assay 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol.
ACK Lysis Buffer NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM
Complete DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL).

Table 1. Specific media used in this protocol

Name of the reagent Company Catalogue number
Ketamine Sigma-Aldrich K2753
Xylazine Sigma-Aldrich X1251
Methylcellulose Sigma-Aldrich M0512-250g
2 x MEM Life Technologies 11935
Cell strainer BD Faclon 352340
Omni tissue homogenizer OMNI International TH115
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
iQTM SYBRH Green Supermix BioRad 170-8882
CFX96 real-time PCR system Bio-Rad 184-5072
Cell counter Bio-Rad 145-0001
Sorvall SA-600 Thermo Scientific 096-124022

Table 2. Specific reagents and equipment

References

  1. Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
  2. Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
  3. Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages. J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).
  4. Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo. J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).
  5. Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection. J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).
  6. Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).
  7. Wen, K. W., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis. Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).
  8. E, X. Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68. PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).
  9. Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes. J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).
  10. McCausland, M. M., Crotty, S. Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo. J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).
  11. Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency. J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).
  12. Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells. J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).

Play Video

Cite This Article
Pirooz, S. D., Lee, J., Zhao, Z., Ni, D., Oh, S., Liang, C. Measurement of γHV68 Infection in Mice. J. Vis. Exp. (57), e3472, doi:10.3791/3472 (2011).

View Video