Måling af γHV68 infektion i Mus
Summary
γ-herpesvirus (γ-HVS) etablere livslang persistens i deres vært. Infektion af mus med γ-HV68 giver en genetisk medgørlige<em> In vivo</em> Model til karakterisering af de livscyklus / patogenesen af γHVs. Denne protokol beskriver påvisning og kvantificering af γHV68 infektion ved akutte og latente følger efter infektion af plak-dannende, smitsomme centrum, og qPCR assays.
Abstract
γ-herpesvirus (γ-HVS) er kendt for deres evne til at etablere latente infektioner af lymfoide celler 1. Den snævre værtsspektrum af menneskelige γ-HVS, såsom EBV og KSHV, har alvorligt hindret detaljerede sygdomsfremkaldende studier. Murine γ-herpesvirus 68 (γHV68) aktier omfattende genetiske og biologiske ligheder med den menneskelige γ-HVS og er en naturlig patogen af murid gnavere 2. Som sådan evaluering af γHV68 infektion af mus indavlede stammer på forskellige stadier af virusinfektion giver en vigtig model for forståelse viral livscyklus og patogenese ved γ-HVS infektion.
Efter intranasal inokulering at γHV68 infektion resulterer i akutte viræmi i lungen er senere løst i en latent infektion i splenocytes og andre celler, som kan blive genaktiveret i hele livet i værtslandet 3,4. I denne protokol, vil vi beskrive, hvordan du bruger plaque assay at vurderes infektiøse virus titer i lungen homogenater på Vero-celle monolag i det tidlige stadium (5 – 7 dage) af post-intranasal infektion (dpi). Mens akut infektion stort set er ryddet 2 – 3 uger postinfection, en latent infektion af γHV68 er etableret omkring 14 dpi og vedligeholdes senere i milten af mus. Latent infektion normalt påvirker en meget lille population af celler i det inficerede væv, hvor virus forbliver sovende og slukker de fleste af sine genekspression. Latent-smittede splenocytes spontant reaktivere virus ved eksplantation i vævskultur, der kan gentages af en smitsom center (IC) assay for at bestemme den virale latente belastning. For yderligere at vurdere mængden af virale genom kopier i akut og / eller latent inficeret væv, kvantitativ real-time PCR (qPCR) bruges til dens maksimale følsomhed og nøjagtighed. Den kombinerede analyser af resultaterne af qPCR og plaque assay, og / eller IC-analysen vil afsløre Spatiotemporal profiler af viralreplikation og smitteevne in vivo.
Protocol
Discussion
γHV68 har været meget anvendt som model for at forstå patogenesen af menneskelige γ-HVS 2,4,5. I denne protokol, beskrev vi tre rutinemæssigt anvendte metoder, herunder plaque assay for smittefarlige virus titer, IC assay for viral latente belastning, og qPCR for virale genom belastning, til at vurdere akutte og latent infektion af γHV68 efter intranasal podning hos mus.
Den plaque assay er blevet brugt i udstrakt grad til at bestemme virus titer i de inficerede celler eller…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende teknisk rådgivning og støtte fra Ren Solen (University of California, Los Angeles) og Seungmin Hwang (Washington University). Dette arbejde blev finansieret af Baxter Foundation, National Institutes of Health tilskud (R01 CA140964 og R21 AI083841 til C. Liang).
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
References
- Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
- Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
- Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages. J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).
- Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo. J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).
- Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection. J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).
- Wen, K. W., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis. Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).
- E, X. Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68. PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).
- Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes. J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).
- McCausland, M. M., Crotty, S. Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo. J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency. J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells. J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).
