Summary
I denne protokollen kombinerer vi RNAi-mediert genet Silencing med en
Abstract
Denne videoen protokollen demonstrerer en effektiv teknikk for å knockdown et bestemt gen i en insekt og gjennomføre en roman bioassay å måle utskillelse rate. Denne metoden kan brukes til å oppnå en bedre forståelse av prosessen diurese i insekter og er spesielt nyttig i studiet av diuresen i blod som ammer leddyr som er i stand til å ta opp store mengder væske i et enkelt måltid blod.
Dette RNAi-mediert genet knockdown kombinert med en in vivo diurese analysen ble utviklet av Hansen lab for å studere effektene av RNAi-mediert knockdown av aquaporin gener på Aedes aegypti mygg diurese en.
Protokollen er oppsettet i to deler: den første demonstrasjonen illustrerer hvordan å konstruere en enkel mygg injeksjon enhet og hvordan man forbereder og injisere dsRNA inn thorax av mygg for RNAi-mediert genet knockdown. Den andre demonstrasjonen viser hvordan du finnerutskillelse priser i mygg ved hjelp av en in vivo bioassay.
Protocol
Del I - RNAi-mediert genet knockdown i voksen Aedes aegypti mygg. For eksperiment oversikt se Figur 1.
1. dsRNA Synthesis
- Syntetisere spesifikke dsRNAs mot gener av interesse og kontroll dsRNAs. Merk: Vi anbefaler utviklingsland primere for PCR fragmenter i området 300 til 500 basepar er plassert på 3 'enden av spesifikke cDNA 2 og med T7 primer sekvensen festet på 5' enden (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 '). Unikhet av fragmentene bør bekreftes ved BLASTN analyse tre.
- Bruk Ambion Megascript T7 High Yield Transcription Kit (Ambion, tabell av reagenser) som utnytter T7 RNA polymerase for transkripsjon reaksjonen å syntetisere dsRNA. Merk: lignende reagenser og kits er tilgjengelig andre steder.
- For å rense dsRNA, bunnfallet med litium klorid følge instruksjonene med Megascript kit.
- Etter purification, oppløse dsRNA pellet i sterilt vann. For å sikre tilstrekkelig viskositet for mikroinjeksjon bør dsRNA konsentrasjonen ikke overstige 2 mikrogram / mL.
2. Injeksjon Forberedelse
- En enkel micro injektor kan konstrueres ved hjelp av rør, saks, et metall nål, en 1 ml sprøyte, og en 1 ml plast pipettespissen (se figur 2). Slangen bør kuttes til ~ 40 cm i lengde. Alternativt kan en automatisert mikro injektor brukes som Drummond Nanojet II 4.
- Skjær tuppen av sprøyten (nålen hub) i 2 ml skala mark og fjerne gummi stempelet hodet fra stempelet.
- Punch et hull med en nål av metall i gummistemplet hodet og sted gummistemplet hodet tilbake i nålen hub.
- Plasser nålen hub i den ene enden av slangen og legg en 1 ml plast pipettespiss i den andre enden, som vil bli brukt som munnen stykke (alternativt en 10 ml syRinge kan brukes til å produsere lufttrykket nødvendig for injeksjon).
- Plasser et glass kapillære nål i hullet i gummistemplet hodet og bryte nålespissen bort, slik at bredden er stor nok for væske kan strømme gjennom. Merk: Den optimale størrelsen på nålespissen må bestemmes empirisk - hvis bredden av nålen er for stor vil dette resultere i traumer og en høy mygg dødelighet, hvis nålen bredden er for liten, vil det være umulig å trenge myggen exoskeleton.
- Senk injeksjonsnålen i den utarbeidede dsRNA prøven og trekke væske prøven inn kanylen ved å suge væsken opp med munnen brikke (eller en sprøyte). Merk: Dette trinnet er identisk for alle flytende reagenser som injiseres inn mygg, inkludert PBS-buffer, som brukes i in vivo diurese analysen protokollen (se nedenfor).
3. Samle og Anesthetize Mygg
- Samlingent mygg med en batteridrevet vifte til en samling hetteglass. Plasser en lue over samlingen hetteglasset og plasser hetteglasset på en ren CO 2 puten anesthetize mygg. Merk: Alternativt mygg kan være bedøvet på isen.
4. Mosquito Injection
- Åpne samlingen hetteglasset og plasser myggen direkte på CO 2 pad og vente til myggen er bedøvet.
- Kast alle hanner.
- Plasser myggen på siden for å tillate enklere tilgang for injeksjon.
- Grab mygg etter bena eller vinger for å unngå skade. Du kan også bruke en fin pensel eller fjær å manipulere mygg.
- Når du er klar til å injisere den første mygg, forsiktig støtte den ene siden av thorax med tang og stikk spissen av nålen i den andre siden av thorax (figur 2). Det er bedre å injisere i en tynn del av skjellaget og unngå å skyve nåleno dypt inn i thorax.
- Når nålen er på plass, blåse væsken i mygg. Ønsket beløp kan bestemmes ved å overvåke væsken menisken i nålen. Antall millimeter nødvendige for et bestemt volum kan bestemmes ved å beregne sylinder volumet av glass kapillær nålen (πr 2 h). Den effektive mengden dsRNA som vanligvis brukes til injeksjon er ett mikrogram.
- Når væsken er injisert inn mygg, forsiktig trekke nålen. Hvis en stor flytende dråpene skjemaer på utsiden av thorax, bør mygg kastes. Deretter gjentar denne prosessen med neste mygg.
5. Mosquito Recovery and Storage
- Etter injeksjon, plasserer myggen i en beholder for oppbevaring. For eksempel, foret en halvliter voks papp kopper (suppe kopper) med mesh tildekking sikret med papp lokk. Lokket har en del kutte ut for mesh dekker å bli utsatt. Når all mosquitoes er plassert i beholderen, plasserer container på en miljømessig kontrollert kammer for inkubering og gi myggen med en mat kilde, for eksempel 20% sukrose dynket bomull baller plasseres på toppen av mesh dekker. Før du utfører in vivo diurese analysen, frata dsRNA-injiserte mygg av en vannkilde i 12 timer på å standardisere den hydrering staten for hver mygg.
- Effektiviteten av dsRNA-mediert genet knockdown kan være variabel. Gene Silencing kunne begynne en dag etter injeksjonen, og det kunne vare opp til 6 dager etter injeksjon fire. Den optimale tidspunktet for å oppnå maksimal genet knockdown må bestemmes empirisk for hvert gen brukt. Vanligvis venter vi 3 dager etter dsRNA injeksjon før vi fortsetter.
Del II - In vivo diurese analysen i voksen Aedes aegypti mygg
Merk: Denne protokollen er utviklet av forfatterne ogbrukes til RNAi-mediert knockdown av aquaporin proteiner i gul feber myggen Aedes aegypti en. For å unngå variasjoner mellom de enkelte mygg, bør mygg bli analysert i grupper. Av tekniske grunner, anbefaler vi grupper på 5 mygg per behandling - det er en begrenset mengde tid til å utføre den første vektmåling før myggen begynner å skille ut urin etter injeksjon.
6. Samle og Anesthetize Mygg
- Før innsamling av mygg, registrere vekten av en tom samling hetteglass med et lokk med en analytisk presisjon balanse. Dette hetteglass skal brukes for alle påfølgende målinger.
- Samle 5 kvinnelige mygg inn i veies samlingen hetteglasset med en vifte. Plasser lokket over samlingen hetteglasset og la den sitte på CO 2 pad flere sekunder for å anesthetize myggen.
7. Initial vektmåling
- Ta than startvekt måling av de 5 myggen ved å plassere samlingen hetteglasset med myggen med hetten på presisjon balanse.
- Beregn vekten av gruppe på 5 mygg ved å ta vekten av mygg og samlingen hetteglasset med cap og trekke fra vekten av den tomme samlingen hetteglasset med cap.
- Åpne samlingen hetteglasset og plasser myggen direkte på CO 2 puten etter opptak vekten av mygg. Hvis myggen begynner å våkne i løpet av måling av vekten, sett hetteglasset på CO 2 pad for flere sekunder før du åpner den og plassere myggen på puten.
8. Injeksjon Forberedelse
- Sett opp micro injektoren følge instruksjonene gitt i RNAi-mediert genet knockdown protokollen.
- Plasser et glass kapillære nål i mikro injektoren og bryte nålespissen bort, slik at bredden er stor nok for liquid å flyte gjennom.
- Senk nålen i PBS-buffer og trekke buffer inn kanylen, er ønsket beløp som skal brukes for denne protokollen 1,25 mL PBS for hver mygg. Merk: Dette beløpet etterligner den gjennomsnittlige mengden av blod plasma som er tatt opp av en kvinnelig mygg 5.
9. Mosquito Injection
- Plasser de myggen for å tillate enklere tilgang med mikro injektoren.
- Når nålen er på plass, blåse PBS buffer til myggen.
- Når væsken er injisert inn i mygg kan en dråpe danne seg på utsiden av thorax. Denne dråpen må nøye fjernes før neste trinn.
- Gjenta denne injeksjon prosessen med neste mygg. Med erfaring, vil myggen overlevelsen være nesten 100% etter injeksjon.
10. Veiing Mygg
- Etter injeksjonen, forsiktig plasserer myggen i samlingen hetteglassetog lue. Ta første vektmåling av de 5 myggen ved å plassere samlingen hetteglasset med myggen med hetten på presisjon balanse.
- Beregn vekten av gruppe på 5 mygg ved å ta vekten av mygg og innsamling ampulle med cap og trekke fra vekten av den tomme samlingen hetteglasset med cap. Merk: mygg vil begynne å skille ut urin innen 2 minutter etter fjerning fra CO 2 anestesi puten, så det er viktig å ta vekten måling før de begynner å skille ut.
- Plasser mygg i en liten beholder hvor de vil begynne å skille ut urin.
11. Andre og påfølgende måling av vekten
Merk: Vekt målinger av myggen bør tas i 30 minutters intervaller, men dette kan justeres til kortere eller lengre intervaller, avhengig utskillelse priser.
- Etter 30 minutter, samle Group av 5 mygg med en vifte i den samme samlingen hetteglasset med cap. Ta neste vektmåling av mygg ved å plassere samlingen hetteglasset med myggen med hetten på presisjon balanse.
- Etter måling, plasserer myggen i samme driftsenheten container for de neste 30 minuttene.
- Gjenta denne prosessen for en ønsket tidsperiode.
12. Bestemme Mosquito Utskillelse pris
- Den totale mengden væske som ble sprøytet inn i gruppe på 5 mygg kan beregnes ved å trekke den opprinnelige vekten av mygg fra vekten umiddelbart etter injeksjon.
- Mengden av urin som ble skilt ut av gruppen av mygg på et bestemt tidspunkt kan beregnes ved å trekke den opprinnelige vekten av mygg fra vekten av mygg på den spesifikke tidspunkt.
- Utskillelsen sats på et bestemt tidspunkt kan beregnes ved utbytteDing mengden urin skilles ut på dette tidspunktet av den totale mengden av væske injisert (Tabell 1).
13. Representative Resultater
RNAi-mediert genet knockdown og in vivo diurese analysen har blitt brukt av Hansen lab for å studere effektene av aquaporins i Aedes aegypti mygg diurese. Tre aquaporins som kommer til uttrykk i Aedes aegypti Malpighian tubuli ble slått ned med signifikante effekter på utskillelse priser i forhold til styre mygg en. Figur 4 viser representative resultatene av et eksperiment der diurese analysen har blitt brukt til å sammenligne utskillelse priser mellom Aedes aegypti og Culex quinquefasciatus ved forskjellige temperaturer.
Figur 1. Flytskjema av RNAi / diurese analysen. 5 grupper på 10 mygg each er injisert med dsRNA for et bestemt gen og ytterligere fem grupper av ti mygg er injisert med kontroll dsRNA. En annen gruppe av mygg injisert med 200 mM HgCl 2 i PBS brukes som en positiv kontroll. Disse mygg veies før injeksjon, og etter injeksjon i tretti minutters intervaller i 3 timer.
Figur 2. En enkel micro injeksjon enhet for RNAi-mediert genet knockdown og in vivo diurese analysen. A. De glass kapillær nåler som brukes til injeksjon. Den grå trekanten representerer millimeter trinn tegnet på nålen for å angi mengden av væske sprøytes inn i mygg. B. 1 ml sprøyte brukes til å konstruere mikro injektoren. Den hvite trekanten representerer nålen hub og den svarte trekanten representerer gummistemplet hodet festet til stempelet i sprøyten. C. Slangen brukes til å feste munnstykket tilinjektoren. D. 1 ml engangs pipettespiss (blå spissen) som brukes som talerør for mikroinjeksjon enheten. E. mikroinjeksjon enhet som inkorporerer AD deler. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Optimal mygg injeksjonsstedet. A. Kvinne Aedes aegypti mygg injisert med et glass kapillær nål mellom de store skjell på forkroppen. Den svarte linjen viser en mm for størrelsen sammenligning. B. En tegning av den kvinnelige mygg thorax og de hvite flekkene representerer hvite skjell i mygg exoskeleton. Kanylen skal pierce myggen mellom stedene for å minimalisere dødeligheten under injeksjon.
Figur 4. Effekter av temperaTure på Culex quinquefasciatus og Aedes aegypti diurese. Den diurese analysen ble utført med to arter av mygg, Aedes aegypti og Culex quinquefasciatus, ved forskjellige temperaturer. Utskillelsen rate i løpet av den første timen etter injeksjon er gitt i prosent.
| Gruppe | TARA (G) | ikke injiseres (G) | etter injeksjon (G) | 1t etter injeksjonen (G) | Gjennomsnittlig vekt (mg) | beløp injisert (ML) | beløp utskilt (ML) | % Utskilles |
| 1 | 7,5938 | 7,6057 | 7,6104 | 7,6096 | 2,38 | 0,94 | 0,16 | 17,0 |
| 2 | 7,8252 | 7,8349 | 7,8415 | 7,8403 | 1,94 | 1,32 | 0,24 | 18,2 |
| 3 | 7,8896 | 7,9026 | 7,9077 | 7.906 | 2.6 | 1,02 | 0,34 | 33,3 |
Tabell 1. Aedes aegypti in vivo diurese analyseresultatene. Rådata fra in vivo diurese analysen utført med Aedes aegypti hunnmyggen ved 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den RNAi protokollen som brukes er utviklet i laboratoriet av Alexander Raikhel ved University of California Riverside 6,7 og ligner på en protokoll publisert av Garver og Dimopoulos 4. Den eksperimentelle tilnærmingen vist i denne videoen protokollen kan brukes til å studere gener involvert i insekt diurese i en in vivo setting. De ekskresjonsfunksjoner organer insekter, de Malpighian tubuli, har tiltrukket seg interesse av generasjoner av forskere som en "enkel" modell system for diurese. Dette organet er involvert i xenobiotics clearance 8 og arbeid i Drosophila har identifisert en rekke gener involvert i Malpighian tubule fysiologi 9,10 som nå kan studeres i andre insektarter med revers genetiske metoder som RNAi. Mange homologe gener kan lett identifiseres i de publiserte genomsekvenser av forskjellige insektarter 11. Tre-dagers gamle mygg ble brukt i denne protokollen, fordi på dette tidspunktet point de blir kompetente til å ta et måltid blod.
Flere andre utskillelse analysene er rapportert. Den klassiske Ramsay analysen har blitt brukt til å studere diurese i isolerte Malpighian tubuli in vitro 12. I denne analysen enkle tubuli er isolert og den distale delen er plassert i en dråpe saltoppløsning mens den proksimale delen er åpen. Vanndrivende aktivitet beregnes ved å måle størrelsen på urin dråpen som danner ved slutten av den proksimale delen. Bruke Ramsay analysen, kan man måle mengder urin produksjonen av individuelle Malpighian tubuli. Vår diurese analysen tillater målinger av hel-mygg utskillelse priser og er derfor ikke et alternativ til Ramsay analysen. I stedet kan begge analysene gi utfyllende informasjon dersom det brukes sammen.
Annen in vivo utskillelse analyser har blitt utviklet for Musca domestica og Aedes aegypti. The M. domestica studie involvered måling av vann tap ved en gjennomstrømning fuktighetsmåler 13. En lignende teknikk som ble brukt til å studere Aedes aegypti diurese ved å måle utskillelse priser ved hjelp av en presisjon fuktighet kammer 14. In vivo diurese analysen som presenteres her er ikke så teknisk krevende som de ovennevnte teknikkene og likevel gir svært nøyaktige data om utskillelse priser i sammenheng med en komplett organisme.
Det er et bredt spekter av fremtidige søknader om in vivo diurese analysen presenteres her. I tillegg til å reversere genetikk metoder som RNAi det kan brukes til å studere effekten av narkotika, for eksempel signaltransduksjonsveiene hemmere mv, på insekt diurese. Det er også et kraftig analyse for å studere prosessen med xenobiotics klarering i mål insekter.
Problemer som vi vil ta mens videreutvikle denne analysen er: A) Konsentrasjonen og sammensetning av injeksjon buffer. Vibrukt PBS for eksperimentene vi utført så langt, men andre buffere som Aedes fysiologisk saltvann 15 kan vise seg å være mer hensiktsmessig for mygg og andre insekter. B) Bruk denne metoden til andre arter, spesielt ikke-blodsugende insekter. De mengder buffer som kan injiseres i slike arter må empirisk bestemmes for hver art. C) Minimer eksperimentell feil. Vi vil optimalisere vår injeksjon og måleteknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Victoria Carpenter for hennes kritiske kommentarer av denne protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion | AM1334 | |
| PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Plastic tubing | Local Supplier | PVC | |
| 1 ml plastic pipette tip | VWR international | 83007-376 | Blue tip |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Scissors | Local Supplier | ||
| Metal needle | Carolina Biological | 654307 | Size 5 |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | |
| Glass capillary needles | World Precision Instruments, Inc. | 1B200-6 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| One pint waxed lined cardboard cups | Local Supplier | Manufactured soup cups | |
| Mesh net | Local Supplier | plastic fly gauze |
References
- Drake, L. L., et al. The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 5, e15578 (2010).
- Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination. Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).
- Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
- Clements, A. N. Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction. The Biology of Mosquitoes. 2, Chapman & Hall. London. (1992).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).
- Pannabecker, T. Physiology of the Malpighian Tubule. Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).
- Dow, J. New insights into Malpighian tubule function from functional genomics. Comp Biochem Phys A. 150, S135 (2008).
- Dow, J. A. T. Insights into the Malpighian tubule from functional genomics. Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).
- Lawson, D., et al. VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics. Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).
- Coast, G. M. Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis. Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).
- Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).
- Hays, A. R., Raikhel, A. S. A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes. Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).
