Summary
Neste protocolo combinamos RNAi mediada silenciamento de genes com um
Abstract
Este protocolo vídeo demonstra uma técnica eficaz para knockdown um determinado gene em um inseto e realizar um bioensaio romance para medir a taxa de excreção. Este método pode ser usado para obter uma melhor compreensão do processo de diurese em insectos e é especialmente útil no estudo da diurese no sangue de alimentação-artrópodes que são capazes de assumir uma grande quantidade de líquido em uma farinha de sangue única.
Este gene knockdown RNAi mediada combinado com um ensaio in vivo de diurese foi desenvolvido pelo laboratório Hansen para estudar os efeitos de RNAi mediada knockdown de genes Aquaporin sobre Aedes aegypti diurese mosquito 1.
O protocolo é configurado em duas partes: a primeira demonstração ilustra como a construção de um dispositivo de injeção simples mosquito e como preparar e injetar dsRNA para o tórax de mosquitos para RNAi mediada knockdown do gene. A demonstração segundo ilustra como determinartaxas de excreção em mosquitos usando um bioensaio in vivo.
Protocol
Parte I - RNAi mediada knockdown do gene na idade adulta do mosquito Aedes aegypti. Para visão geral experimento veja a Figura 1.
1. Síntese dsRNA
- Sintetizar dsRNAs específicas contra genes de dsRNAs de juros e controle. Nota: Sugerimos iniciadores em desenvolvimento para os fragmentos de PCR na gama de 300 a 500 pares de bases localizado na extremidade 3 'do cDNA específico 2 e com a sequência de iniciador de T7 ligado na extremidade 5' (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 '). Singularidade dos fragmentos deve ser confirmado por análise BLASTN 3.
- Utilizar a Ambion Megascript T7 Kit de Transcrição de Alto Rendimento (Ambion, a tabela de reagentes) que utiliza-polimerase de T7 RNA para a reacção de transcrição para sintetizar ARNdc. Nota: Os reagentes semelhantes e kits estão disponíveis em outros lugares.
- Para purificar ARNdc, precipitado com cloreto de lítio, seguindo as instruções com o kit de Megascript.
- Depois purificatiónica, dissolver o sedimento ARNdc em água estéril. Para assegurar a viscosidade adequada para microinjecção, a concentração de ARNdc não deve exceder 2 ug / uL.
2. Preparação de injecção
- Um simples micro injector pode ser construído utilizando tubos, uma tesoura, uma agulha de metal, uma seringa de 1 ml, e uma 1 ml em plástico pipeta de ponta (ver Figura 2). O tubo deve ser cortado para ~ 40 cm de comprimento. Alternativamente, um injector automático de micro pode ser usado como Drummond Nanojet II 4.
- Cortar a ponta da seringa (cubo de agulha) em 2 ml marca escala e remover a cabeça do êmbolo de borracha a partir do êmbolo.
- Faça um furo com uma agulha de metal na cabeça do êmbolo de borracha e coloque a cabeça do êmbolo de borracha de volta no centro da agulha.
- Coloque o cubo da agulha em uma extremidade do tubo e colocar uma ponta de pipeta de 1 ml de plástico na outra extremidade, a qual será usada como a peça para a boca (alternativamente, um 10 ml syRinge pode ser usado para produzir a pressão de ar necessária para a injecção).
- Colocar uma agulha capilar de vidro, no furo na cabeça do êmbolo de borracha e quebrar a ponta da agulha fora de modo a largura é suficientemente grande para líquido a fluir através dele. Nota: O tamanho óptimo da ponta da agulha tem de ser determinada empiricamente -, se a largura da agulha é demasiado grande isso irá resultar em trauma e uma elevada taxa de mortalidade de mosquito, se a largura da agulha é muito pequeno, será impossível para penetrar o exoesqueleto de mosquito.
- Submergir a agulha de injecção na amostra ARNdc preparada e extrair a amostra de líquido para dentro da agulha de injecção por sucção o líquido para cima com a peça de boca (ou uma seringa). Nota: Este passo é idêntico para todos os reagentes líquidos que são injectados nos mosquitos, incluindo tampão PBS, que é utilizado in vivo no protocolo de ensaio de diurese (ver abaixo).
3. Coletar e Anestesie mosquitos
- Coleçãomosquitos de t com um aspirador alimentado por bateria para um frasco de coleta. Coloque uma tampa sobre o frasco de coleta e coloque o frasco em uma almofada limpa CO 2 para anestesiar os mosquitos. Nota: Como alternativa os mosquitos podem ser anestesiados em gelo.
4. Injeção de Mosquito
- Abra o frasco de coleta e colocar os mosquitos diretamente no bloco de CO 2 e esperar até os mosquitos são anestesiados.
- Descarte todos os homens.
- Alinhar os mosquitos no lado para permitir um acesso mais fácil para injecção.
- Agarre mosquitos pelas pernas ou asas para evitar ferimentos. Você também pode usar um pincel fino ou pena para manipular os mosquitos.
- Quando pronto para injectar o mosquito em primeiro lugar, suavemente suportar um lado do tórax com a pinça e inserir a ponta da agulha para o outro lado do tórax (Figura 2). É melhor injetar uma porção fina da cutícula e evitar empurrar a agulha paraó profundo no tórax.
- Uma vez que a agulha está no lugar, soprar o líquido para dentro do mosquito. A quantidade desejada pode ser determinada através da monitorização do menisco de líquido na agulha. O número de milímetros necessárias para um volume específico pode ser determinada por cálculo do volume do cilindro da agulha capilar de vidro (πr 2 h). A quantidade eficaz de ARNdc que é tipicamente usada para injecção é de 1 ug.
- Uma vez que o líquido é injectado mosquito, cuidadosamente retrair a agulha. Se um formas líquidas grandes gotículas do lado de fora do tórax, o mosquito deve ser descartado. Em seguida, repita esse processo com o mosquito que vem.
5. Recuperação Mosquito e Armazenamento
- Após a injecção, colocar os mosquitos em um recipiente para armazenagem. Por exemplo, uma cera de forrado pint copos de papelão (copos de sopa) com malha de recobrimento protegido com a tampa de cartão. A tampa tem uma parte cortada para a malha que cobre a ser exposto. Uma vez que todo o mosquitoes são colocados no recipiente, colocar o recipiente numa câmara de ambiente controlado, após a incubação e fornecer os mosquitos com uma fonte de alimento, tal como 20% de sacarose bolas de algodão embebidas colocados em cima da cobertura de malha. Antes de realizar o ensaio in vivo de diurese, privar os mosquitos dsRNA com injeção de uma fonte de água por 12 horas para normalizar o estado de hidratação de cada mosquito.
- A eficiência de ARNdc mediada knockdown do gene pode ser variável. Silenciamento gênico pode começar um dia após a injeção e pode durar até 6 dias após a injecção 4. O tempo ideal para atingir knockdown gene máxima tem de ser determinada empiricamente para cada gene utilizado. Geralmente, temos que esperar 3 dias após a injeção do dsRNA antes de prosseguir.
Parte II - In vivo ensaio diurese em adulto do mosquito Aedes aegypti
Nota: Este protocolo foi desenvolvido pelos autores eutilizado para RNAi mediada knockdown de proteínas Aquaporin no mosquito da febre amarela Aedes aegypti 1. Para evitar a variabilidade entre os mosquitos individuais, mosquitos devem ser analisadas em grupos. Por razões técnicas, recomendamos grupos de 5 mosquitos por tratamento - há uma quantidade limitada de tempo para realizar a medição de peso antes de mosquitos começam a excretar urina após a injeção.
6. Coletar e Anestesie mosquitos
- Antes da coleta dos mosquitos, registrar o peso de um frasco coleção vazia com uma tampa com uma balança de precisão analítica. Este frasco vai ser utilizado para todas as medições subsequentes.
- Collect 5 mosquitos fêmeas para dentro do frasco de recolha pesados com um aspirador. Coloque a tampa sobre o frasco de coleta e deixá-lo sentar-se no bloco de CO 2 por alguns segundos para anestesiar os mosquitos.
7. Pesagem inicial
- Tome tele medição de peso inicial dos 5 mosquitos, colocando o frasco de recolha contendo os mosquitos, com a tampa sobre a balança de precisão.
- Calcular o peso do grupo de 5 mosquitos, tendo o peso dos mosquitos e do frasco com tampa de recolha e subtraindo o peso do frasco de recolha vazio com tampa.
- Abrir o frasco de recolha e colocar os mosquitos directamente sobre a almofada de 2 CO após a gravação do peso dos mosquitos. Se os mosquitos estão começando a acordar durante as medições de peso, definir o frasco no bloco de CO 2 por alguns segundos antes de abri-lo e colocar os mosquitos no teclado.
8. Preparação de injecção
- Configure o injector micro seguindo as instruções dadas no protocolo knockdown RNAi mediada por gene.
- Colocar uma agulha capilar de vidro, no injector micro e quebrar a ponta da agulha fora de modo a largura é suficientemente grande para liquid para fluir.
- Agulha submergir o em tampão PBS e desenhar o tampão para dentro da agulha de injecção, a quantidade desejada a utilizar para este protocolo é de 1,25 ul de PBS para cada mosquito. Nota: Este montante imita a quantidade média de plasma sanguíneo que é absorvido por um mosquito fêmea 5.
9. Injeção de Mosquito
- Alinhe-se os mosquitos para permitir um acesso mais fácil com o injector micro.
- Uma vez que a agulha está no lugar, fundir tampão PBS para o mosquito.
- Uma vez que o líquido é injectado no mosquito, uma gotícula pode formar no lado de fora do tórax. Este gotícula tem de ser cuidadosamente removido antes do passo seguinte.
- Repita este processo de injeção com o mosquito que vem. Com a experiência, a taxa de sobrevivência do mosquito será quase 100% após a injeção.
10. Os mosquitos de pesagem
- Após a injeção, coloque delicadamente os mosquitos no vidro de coletae cap. Fazer a medição de peso primeiro dos 5 mosquitos, colocando o frasco de recolha contendo os mosquitos, com a tampa sobre a balança de precisão.
- Calcular o peso do grupo de 5 mosquitos, tendo o peso dos mosquitos e do frasco com tampa de recolha e subtrair o peso do frasco de recolha vazio com tampa. Nota: os mosquitos começam a excretar urina dentro de 2 minutos após a remoção do bloco de anestesia CO 2, por isso é importante para fazer a medição de peso antes de começar a excretar.
- Coloque mosquitos em um pequeno recipiente onde eles começarão a excretar urina.
11. Segundo e subsequentes medidas de peso
Nota: As medidas de peso dos mosquitos devem ser tomadas em intervalos de 30 minutos, mas este pode ser ajustado para intervalos mais curtos ou mais longos, dependendo taxas de excreção.
- Após 30 minutos, recolher o group de 5 mosquitos com um aspirador para o frasco mesma coleção com tampa. Fazer a medição de peso próximo dos mosquitos, colocando o frasco de recolha contendo os mosquitos, com a tampa sobre a balança de precisão.
- Após a medição, colocar os mosquitos no recipiente mesma exploração para os próximos 30 minutos.
- Repetir este processo para um período de tempo desejado.
12. Taxa de excreção de determinar Mosquito
- A quantidade total de líquido que foi injectado no grupo de 5 mosquitos pode ser calculado subtraindo o peso inicial dos mosquitos a partir do peso imediatamente após a injecção.
- A quantidade de urina, que foi excretada pelo grupo de mosquitos em um ponto de tempo específico pode ser calculado subtraindo o peso inicial dos mosquitos a partir do peso dos mosquitos no ponto de tempo específico.
- A taxa de excreção, num ponto de tempo específico pode ser calculado por diviDing a quantidade de urina excretada, neste ponto do tempo pela quantidade total de líquido injectado (Tabela 1).
13. Os resultados representativos
RNAi mediada knockdown do gene e in vivo ensaio diurese têm sido utilizados pelo laboratório Hansen para estudar os efeitos de aquaporinas em Aedes aegypti diurese mosquito. Três aquaporinas que são expressas em Aedes aegypti Malpighian túbulos foram derrubados com efeitos significativos sobre a taxas de excreção comparados para controlar mosquitos 1. A Figura 4 mostra resultados representativos de uma experiência em que o ensaio de diurese foi utilizado para comparar taxas de excreção entre Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus a temperaturas diferentes.
Figura 1. Fluxograma do ensaio RNAi / diurese. 5 grupos de 10 mosquitos each são injectados com ARNdc de um gene específico e de outros cinco grupos de dez mosquitos são injectados com o controle de ARNdc. Outro grupo de mosquitos injectados com 200 uM HgCl 2 em PBS é usado como um controlo positivo. Estes mosquitos são pesados antes da injecção, e após a injecção, em trinta minutos de intervalo durante 3 horas.
Figura 2. Um dispositivo de injeção simples micro para o knockdown do gene RNAi mediada e ensaio in vivo de diurese. A. As agulhas capilares de vidro utilizado para injecção. O triângulo cinza representa os incrementos de milímetro desenhadas na agulha para indicar a quantidade de líquido injectado no mosquito. B. 1 seringa ml usado para construir o injector micro. O triângulo branco representa o cubo da agulha e do triângulo preto representa a cabeça do êmbolo de borracha ligado ao êmbolo na seringa. C. O tubo usado para prender o porta-voz parao injector. D. 1 ml ponta de pipeta descartável (ponta azul), que é utilizado como o bocal do dispositivo de microinjecção. E. O dispositivo microinjeção que incorpora partes AD. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Local da injecção óptima do mosquito. A. Fêmea Aedes aegypti injectados com uma agulha capilar de vidro entre as escalas grandes no tórax. A barra preta indica 1 mm para comparação de tamanho. B. Um desenho do tórax mosquito fêmea e as manchas brancas representam as escamas brancas no exoesqueleto de mosquito. A agulha de injeção deve furar o mosquito entre os pontos para minimizar a taxa de mortalidade durante a injeção.
Figura 4. Efeitos da temperaturasas de Culex quinquefasciatus e diurese Aedes aegypti. O ensaio de diurese foi realizada com duas espécies de mosquitos, Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus, a temperaturas diferentes. A taxa de excreção durante a primeira hora após a injecção é dada em percentagem.
| Grupo | TARA (G) | não injectada (G) | após a injecção (G) | 1h após a injecção (G) | peso médio (mg) | quantidade injectada (Ul) | quantidade excretada (Ul) | % Excretado |
| 1 | 7,5938 | 7,6057 | 7,6104 | 7,6096 | 2,38 | 0,94 | 0,16 | 17,0 |
| 2 | 7,8252 | 7,8349 | 7,8415 | 7,8403 | 1,94 | 1,32 | 0,24 | 18,2 |
| 3 | 7,8896 | 7,9026 | 7,9077 | 7,906 | 2,6 | 1,02 | 0,34 | 33,3 |
Tabela 1. Aedes aegypti em resultados do ensaio in vivo diurese. Dados brutos de ensaio in vivo de diurese realizada com Aedes aegypti fêmea mosquitos a 4 ° C.
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Discussion
O protocolo utilizado RNAi foi desenvolvido no laboratório de Alexander Raikhel da Universidade da Califórnia Riverside 6,7 e é semelhante a um protocolo publicado por Garver e Dimopoulos 4. A abordagem experimental mostrado neste protocolo de vídeo pode ser usado para estudar os genes envolvidos na diurese de insectos em uma configuração em in vivo. Os órgãos excretores dos insetos, os túbulos de Malpighi, têm atraído o interesse de gerações de pesquisadores como um sistema modelo "simples" para a diurese. Este órgão está envolvido em xenobióticos folga 8 e trabalho em Drosophila identificou numerosos genes envolvidos no túbulo de Malpighi fisiologia 9,10 que agora pode ser estudada em outras espécies de insetos com métodos genéticos reversa como RNAi. Muitos genes homólogos podem ser facilmente identificados nas sequências genómicas publicadas de espécies de insectos vários 11. Três dias de idade foram usados mosquitos neste protocolo porque neste poi tempont tornam-se competente para tomar uma refeição de sangue.
Vários ensaios de excreção outros têm sido relatados. O ensaio de Ramsay clássico tem sido utilizada para estudar a diurese em isolados túbulos de Malpighi in vitro 12. Neste ensaio túbulos individuais são isolados ea parte distai é colocado em uma gota de solução salina enquanto que a parte proximal é aberta. Actividade diurética é calculada medindo o tamanho da gotícula de urina que se forma na extremidade da parte proximal. Usando o ensaio Ramsay, pode-se medir a quantidade de produção de urina pelos diferentes túbulos de Malpighi. Nosso ensaio diurese permite medições de taxas de todo-mosquito de excreção e é, portanto, não uma alternativa para o ensaio de Ramsay. Em vez disso, ambos os ensaios podem fornecer informação complementar se utilizados em conjunto.
Outros em ensaios de excreção in vivo têm sido desenvolvidos para Musca domestica e Aedes aegypti. O M. domestica estudo envolved da medição da perda de água por um medidor de humidade por escoamento 13. Uma técnica semelhante foi utilizada para estudar Aedes aegypti diurese medindo taxas de excreção, utilizando uma humidade precisão câmara 14. O ensaio in vivo de diurese aqui apresentados não é tão tecnicamente exigentes como as técnicas acima mencionadas e, no entanto, produz dados muito precisos sobre as taxas de excreção no contexto de um organismo completo.
Existe uma vasta gama de aplicações futuras para o ensaio in vivo de diurese aqui apresentado. Além disso para inverter métodos de genética como RNAi ele pode ser usado para estudar o efeito da droga, para os inibidores exemplo de transdução de sinal, etc, em diurese insecto. É também um ensaio poderoso para estudar o processo de apuramento xenobióticos em insectos alvo.
Os problemas que iremos endereço enquanto continuar a desenvolver neste ensaio são: a) a concentração e composição do tampão de injecção. NósPBS utilizado para os experimentos realizados nos buffers, até agora, mas outros como o Aedes soro fisiológico 15 pode vir a ser mais apropriado para mosquitos e outros insetos. B) A aplicação deste método para outras espécies, especialmente insectos sugadores de sangue não-. As quantidades de tampão que podem ser injectadas em tais espécies tem de ser determinada empiricamente para cada espécie. C) minimizar o erro experimental. Vamos otimizar nossa injeção e técnicas de medição.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem Victoria Carpenter por seus comentários críticos deste protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion | AM1334 | |
| PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Plastic tubing | Local Supplier | PVC | |
| 1 ml plastic pipette tip | VWR international | 83007-376 | Blue tip |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Scissors | Local Supplier | ||
| Metal needle | Carolina Biological | 654307 | Size 5 |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | |
| Glass capillary needles | World Precision Instruments, Inc. | 1B200-6 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| One pint waxed lined cardboard cups | Local Supplier | Manufactured soup cups | |
| Mesh net | Local Supplier | plastic fly gauze |
References
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