Summary
En vedhæftning frekvens-analysen til måling af receptor-ligand interaktion kinetik, når begge molekyler er forankret på overfladen af de vekselvirkende celler er beskrevet. Dette mekanisk-baserede assay er eksemplificeret ved hjælp af en mikropipette-tryk humane røde blodlegemer som vedhæftning sensor og integrin αLβ2 og intercellulære adhæsionsmolekyle-1 som vekselvirkende receptorer og ligander.
Abstract
Den mikropipette vedhæftning assay blev udviklet i 1998 til at måle todimensionale (2D) receptor-ligand binding kinetik 1. Analysen anvender en menneskelig røde blodlegemer (RBC) som vedhæftning sensor og præsentere celle til en af de interagerende molekyler. Virksomheden beskæftiger mikromanipulering at bringe RBC i kontakt med en anden celle, der udtrykker den anden interagere molekylet med præcist kontrollerede område og tid til at gøre det muligt for obligationen dannelse. Vedhæftningen Arrangementet er detekteret som RBC forlængelse på at trække de to celler fra hinanden. Ved at styre tætheden af ligander immobiliseret på RBC overfladen, er sandsynligheden for vedhæftning holdes i mid-range mellem 0 og 1. Vedhæftningen Sandsynligheden er estimeret ud fra hyppigheden af friktion begivenheder i en sekvens af gentagen kontakt cyklusser mellem de to celler for en given kontakttid. Varierende kontakten tid genererer en bindende kurve. Montering af en probabilistisk model for receptor-ligand reaktionskinetik 1 til bindendekurve returnerer 2D affinitet og off-sats.
Analysen er valideret ved hjælp af interaktioner mellem Fcγ receptorer med IgG Fc 1-6, selectins med glycoconjugate ligander 6-9, integriner med ligander 10-13, homotypical cadherin bindende 14, T-celle receptoren og coreceptor med peptid-dur histocompatibility komplekser 15 - 19.
Metoden har været anvendt til at kvantificere reglerne i 2D kinetik af biofysiske faktorer, såsom den membran microtopology 5, membran anker 2, molekylære orientering og længde 6, transportør stivhed 9, krumning 20, og impingement kraft 20, samt biokemiske faktorer, såsom modulatorer af cytoskeleton og membran mikromiljø hvor vekselvirkende molekyler bor og overfladen organiseringen af disse molekyler 15,17,19.
Metoden er også blevet brugt to undersøge den samtidige bindingen af dual-receptor-ligand arter 3,4, og trimolecular interaktioner 19 ved hjælp af en modificeret model 21.
Den største fordel ved metoden er, at det giver mulighed for undersøgelse af receptorer i deres oprindelige membran miljø. Resultaterne kan være meget forskellige fra indhentet dem, der bruger renset receptorer 17. Det giver også mulighed undersøgelse af receptor-ligand interaktioner i en sub-sekunders tid med tidsmæssige opløsning langt ud over den typiske biokemiske metoder.
For at illustrere mikropipette vedhæftning hyppigheden metode, vi viser kinetik måling af intercellulære adhæsionsmolekyle 1 (ICAM-1) funktionaliserede om RBC binding til integrin α L β 2 på neutrofile med dimerisk E-selektin i løsningen for at aktivere α L β 2.
Protocol
1. RBC isoleret fra fuldblod
- Forbered EAS-45 løsninger. Afvejning af alle ingredienser fra tabel I og opløses i 100-200ml af DI vand. Tilsæt vand for at lave 1000ml løsning og justere pH til 8,0. Filter og alikvot af 50ml. Fryses ved -20 ° C til opbevaring.
Bemærk: Trin 1,2 skal udføres af en uddannet læge, såsom en sygeplejerske, en institutionel Review Board godkendte protokol.
- Tegn 3-5 ml blod fra median kubiske vene i et 10 ml rør, der indeholder EDTA og forsigtigt blande blod med EDTA omgående og grundigt for at undgå koagulation.
- Proces blodprøve så hurtigt som muligt. Alle de følgende trin undtagen centrifugering bør ske under overfladen for at holde præparatet sterile. Overfør blodet til et 50 ml centrifugeglas, der tilsættes 10 ml af kolde og sterile Histopaque 1077 og centrifuger i 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Gentag to gange.
- Tilsæt 10ml kold og steril PBS, centrifugeres i 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Fjern supernatanten. Gentag 4 gange (i alt 5 gange).
- Vask med sterile EAS-45 (5min @ 1000rpm, 4 ° C) to gange. Under sidste vask flytte RBC ind i en ny steril 15ml tube.
- Resuspender RBC in10ml EAS-45.
2. RBC biotinylation
- Tag røret med RBC fra trin 1. Fjern alle supernatanten efter centrifugering i 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Put 10μl af RBC pille til hver af flere hætteglas og tilsæt tilsvarende mængde af PBS til hvert hætteglas (se tabel II for eksempel udarbejdelse af seks forskellige RBC biotinylation koncentrationer).
- Gør frisk Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 fortyndinger i henhold til tabel II.
- Tilføj 10μl af 0,1 M borat buffer til hvert hætteglas.
- Tilsæt beregnede mængde af biotin løsning til hvert hætteglas (se tabel II som eksempel) og vortex straks.
- Sted hvert RBC hætteglasinde i en 50ml konisk rør og inkuber om rotator til 30min ved stuetemperatur.
- Vask hvert hætteglas 3 gange med 800μl af EAS-45 til 2min @ 2000rpm.
- Tilføj 100μl af EAS-45 til hvert hætteglas og opbevares ved 4 ° C. I hvert 1μl af den endelige løsning nu skal ~ 1mln af RBC.
3. Functionalizing det biotin-linked ligander * på røde blodlegemer
- Forbered 2mg/ml streptavidin løsning i overensstemmelse med producentens anvisninger. Aliqouted opløsning kan opbevares ved -20 ° C.
- Bland en lige stor del af RBC fra trin 2,7 (10μl) med streptavidin løsning, Vortex straks og inkuber om rotator til 30min ved 4 ° C.
- Vask 3 gange med 500μl af EAS-45 til 2min @ 2000rpm. Tilføj 15μl EAS-45 / 1% BSA til opbevaring.
- Bland lige mængden af røde blodlegemer fra trin 3.3 (10μl) med 20μg/ml ligand løsning, Vortex straks og inkuber om rotator til 30min ved stuetemperatur.
- Vask to gange med 500μl af EAS-45 / 1% BSA 2min @ 2000rpm. Tilføj 15μl af EAS-45 / 1% BSA til opbevaring.
* Hvis din protein har ingen biotin link kan du benytte en af de kommercielt tilgængelige kits for protein biotinylation (for eksempel, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation Kit) eller bruge biotinylerede indfange antistoffer som et mellemliggende skridt, som vist i videoen.
4. Kvantificering af receptor og ligand tætheder
- Inkubér ligand-belagt RBC fra trin 3 og, i et andet hætteglas, receptor-bærende celler med mætte koncentrationer af de respektive MAB for 30min ved stuetemperatur. Inkuber i separate hætteglas celler med irrelevante isotype-matchede antistoffer til kontrol. Hvis den primære antistoffer ikke er fluorescens-mærkede, inkuberes med fluorescens-konjugerede sekundære antistoffer i henhold til producentens anvisninger.
- Analysere prøver forberedt i trin 4.1 ved flow cytometery med tilsvarende fluorescerende calibration perler. Beregn tætheder som vist i Fig. 1.
5. Forberedelse til mikropipette og celle kammer
- Træk mikropipetter fra kapillarrør ved hjælp af PN-30 Narishige 'Magnetic Glas mikroelektrode Vandret Puller eller Sutter Instrumenter Mikropipette Puller.
- Brug mikromanipulator med microforge at justere spidsen af trak mikropipette til en ønsket størrelse (som regel den ønskede diameter spænder fra 1-5μm afhængigt af størrelsen af de celler, der skal bruges i undersøgelsen).
- Forbered cellen kammeret ved at skære Microscope Cover Glass til den ønskede størrelse. Seal kammeret ved hjælp af mineralolie fra begge parter til at undgå medie fordampning til at ændre osmolariteten under eksperimentet.
- Tilsæt receptor-og ligand-bærende celler til kammeret.
6. Mikropipette vedhæftning frekvens analyse
- Aspirer de interagerer celler ved respektive pipetter og bruge computer-programmeret piezoelectr IC oversætter til at drive RBC ind og ud af kontakt med den anden celle med kontrolleret kontakt areal og tid. Detect vedhæftning begivenheder ved at observere RBC forlængelse på celleseparering.
- Gentag kontakt-dementi cyklus 50-100 gange for en given kontakttid. Optag den observerede vedhæftning begivenheder ved at tilføje "1" for vedhæftning eller "0" for ingen vedhæftning i en kolonne af Excel regneark. Du kan bruge en optageenhed, f.eks, digitale medier eller videobånd, til mikroskopiske billeder.
- Optag vedhæftning frekvens versus kontakt tidskurven at anvende mindst tre forskellige celle par for hver kontaktperson tid til at opnå en gennemsnitlig og SEM.
- Optag uspecifik binding kurven for kontrol ved hjælp af røde blodlegemer belagt med irrelevante ligander (f.eks BSA) og / eller blokering af ligander eller receptorer ved hjælp af deres specifikke funktionelle blokade MAB. Specifikke vedhæftning frekvens på hver kontakt tidspunkt kan beregnes ved fjernelse af uspecifikke vedhæftning frekvens 1.
- Passe til de specifikke vedhæftning frekvens P a versus kontakt tidspunkt t data ved en probabilistisk model (Ligning 1), der beskriver en anden orden frem og første-ordens omvendt, ét skridt samspil mellem en enkelt art af receptorer og en enkelt art af ligander 1 :
hvor K a er 2D effektiv bindingsaffiniteten, k off er off-sats, m r og m l er de respektive receptor og ligand tæthed målt i trin 4, og A c er kontakten området. Den kurve-fit har to parametre, A c K a og k off, som A c og K er er slået sammen og kaldes kollektivt som effektive 2D affinitet. Sit produkt med off-sats er den effektive 2D-on-sats: A C K on = A c K er x k off.
De specifikke vedhæftning frekvens P a beregnes ved fratrækning af uspecifikke adhæsion fraktion (P uspecifik) fra den samlede målte vedhæftning (P målt) 1,21:
8. Repræsentative resultater:
Figur 1 Bestemmelse af integrin α L β 2 Site tæthed på neutrofile. Neutrofile blev først inkuberet med 1μg/ml af E-selektin-Ig til 10min at matche de eksperimentelle tilstand anvendes i figur 3,4 eller uden E-selektin-Ig, og derefter med mætte koncentrationer (10μg/ml) af PE-konjugeret anti -menneskelige CD11a mAb (klon HI111, se tabel af specifikkereagenser og udstyr) eller irrelevante muse-IgG1 for kontrol, vasket, og analyseres med det samme. Prøverne blev læst på BD LSR flowcytometer med standard QuantiBRITE PE kalibrering perler. Panel A viser fluorescens histogrammer af kalibrering perler (lyserød) sammen med de af E-selektin-Ig behandlet (blå farve) eller ubehandlede celler (grøn farve). Specifikke CD11a mAb farvning er vist i massivt kurver og irrelevante isotype-matchede kontrol antistof farvning vises i stiplede kurver. Celler behandlet med E-selektin-Ig (tilstedeværelse i alle vasketrin og i FACS buffer) påvirkede ikke CD11a tæthed, som fremgår ved en sammenligning med ubehandlede celler. Panel B viser processen med tæthed kvantificering. Log10 var beregnet for den gennemsnitlige fluorescensintensitet (FI) af hver top værdi af fire kalibrering perle histogrammer fra Panel A (pink cirkler) og for lot-specifikke PE-molekyler pr perle (fra fabrikanten). En lineær regression af log10 PE-molekyler per perle mod log10 fluorescning var plottet. For E-selektin behandlede celler log10-FI (y)-værdier lig 3.99 (blå massiv cirkel) og 2,23 (blå åben cirkel) for specifikke mAb og kontrol antistof, respectivly. Vi løste den lineære ligning for x (værdier er plottet som grønne og blå cirkler på Panel B) x = log10 PE / celle, og som PE:. MAb var forholdet 1:1, det samlede antal α L β 2 på neutrofiler var beregnet som 9587. Overfladekoncentrationen blev beregnet til 43 molekyler / μm 2, ved hjælp 8.4μm som det neutrofile diameter 22. Tæthed af ICAM-1 blev ligeledes målt ved flow cytometery bruge PE-anti-humant CD54 mAb, hvilket svarede til 65 mol / μm 2.
Figur 2 Mikropipette systemet diagrammer. Vores mikropipette system var samlet i huset og består af tre delsystemer: et billedbehandlingssystem delsystem der tillader en at observere, recORD og analysere bevægelser mikropipette-indsugning celle, en mikromanipulering delsystem til, at man for at vælge de celler fra cellen kammeret, og et tryk delsystem der tillader en at aspirere cellerne til mikropipetter. Det centrale stykke af imaging delsystemet er inverteret mikroskop (Olympus IMT-2 IMT2) med en 100x olieimmersion 1,25 NA mål. Billedet sendes til en videobåndoptager ved hjælp af en afgift Couple Device (CCD) kamera. En video timeren er koblet til systemet for at holde styr på tiden. Hver mikropipette kan manipuleres af en mekanisk drevet monteret på mikroskopet og fint placeret med en tre-akse hydrauliske mikromanipulator. Mekanisk manipulatorer fra Newport kunne bruges som godt. En af de mikropipette indehavere er monteret på en piezoelektrisk oversætter, er føreren, der styres af en computer LabView-kode (kan rekvireres) og signalet oversætter gennem et DAQ bestyrelsen via en spændingsforstærker (hjemmelavet) til piezo aktuator. Dette er enllows én til at flytte pipetten præcist og repeatably i en vedhæftning testcyklus. Den trykregulering delsystem bruges til at styre suge under forsøget. En hydraulisk linje forbinder mikropipette indehaveren til en væskebeholder. En fin mekanisk positioner giver højden af reservoiret til at være netop manipuleret.
Mikropipetter genereres ved hjælp af KIMAX smeltepunkt borosilikatglas kapillarrør (med udvendig diameter på 1,0 ± 0,07 mm og en indvendig diameter på 0,7 ± 0,07 mm. For det første er de mikropipetter fra kapillærrør trukket med PN-30 Narishige 'Magnetic Glas mikroelektrode Vandret Puller (Sutter Instrumenter Mikropipette Puller er en anden aftrækker option). andet, Microforge system (bygget i hus) bruges til at skære mikropipetter til den ønskede størrelse åbning. Commercial modeller af Microforge systemer er tilgængelige som godt.
For at undgå vibrationer af mikropipetter under eksperimentet, den microscOPE, sammen med micromanipulators, placeret er på en luftaffjedring bord.
Figur 3 Kørsel vedhæftning frekvens F i for specifikke (A) og uspecifikke (B) bindende på 1s (rød) og 10s (blå) kontakt gange målt fra gentagne vedhæftning prøvecyklusser mellem RBC'er belagt med ICAM-1 (A) eller hIgG (B ) med humane neutrofile udtrykke integrin α L β 2. F i = (X 1 + X 2 + ... + X i) / I (1 ≤ i ≤ n), hvor jeg er testcyklussen indekset, X i er lig med "1" (vedhæftning) eller "0" (ingen vedhæftning). F n (n = 50) blev brugt som det bedste skøn for vedhæftning sandsynlighed.
Figur 4 Kinetics afICAM-1 binding til neutrofil integrin α L β 2 ( 
). Vedhæftning måles sandsynligheden som vist i figur 3 for tre celle par på hver kontakt tid er udlignes og afsættes mod kontakt tid. Kammeret medie var HBSS med 1 mm hver af Ca 2 + og Mg 2 + plus 1μg/ml af dimerisk E-selektin-Ig til upregulate α L β 2 bindende. For at fange ICAM-1-Ig på røde blodlegemer, et mellemliggende skridt blev tilføjet til inkuber RBC med 10μg/ml indfange antistof (biotinyleret gede-anti-human Fc antistof, eBioscience) efter streptavidin inkubation. Til kontrol for uspecifik binding to forskellige tilstande blev anvendt: 1) RBC belagt med anti-humane-Fc indfange antistof og inkuberes med humant IgG i stedet for ICAM-1-Ig (O) og 2) neutrofiler binding til RBC ikke er belagt med indfange antistof (Δ). 10μg/ml humant IgG blev tilføjet til mediet for at minimere binding af E-Selektin-Ig i opløsning til fange antistof på RBC overfladen. Uspecifik binding registreret som humant IgG kontrol kurve blev brugt til at opnå et bestemt vedhæftning sandsynlighed kurven ( 
) Ved hjælp af Eq. 2. Montering specifikke vedhæftning sandsynlighed kurve med Eq. 1 (fuldt optrukket linie) returnerede effektive bindingsaffinitet A c K a = 1,4 • 10 -4 μm4 og k off = 0,3 s -1.
| Reagens | MW (g / mol) | Koncentration (MM) | Mængde (g) |
|---|---|---|---|
| Adenin | 135,13 | 2 | 0,27 |
| D-glucose (dextrose) | 180,16 | 110 | 19,82 |
| D-mannitol | 182,17 | 55 | 10,02 |
| Natriumklorid (NaCl) | 58,44 | 50 | 2,92 |
| Natrium, dibasisk (Na HPO ) | 141,95 | 20 | 2,84 |
| L-glutamin | 146,15 | 10 | 1,46 |
Tabel 1. EAS-45 buffer forberedelse (1L).
| 25 mg biotin-XHS i 550 μl af DMF | 0.1M biotin løsning |
| 1:10 fortynding på 0,1 biotin w / DMF | 0.01M biotin løsning |
| 1:100 fortynding på 0,1 biotin w / DMF | 0.001M biotin løsning |
Tabel 2. Forberedelse af biotin løsning.
| biotin endelige koncentration (μM) | 4 | 10 | 20 | 50 | 100 | 160 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| RBC pellet materiel (μl) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1x PBS (μl) | 179,2 | 178 | 176 | 179 | 178 | 176,8 |
| 0,1 M borat buffer (μl) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 0.01M biotin løsning (μl) | 1 | 2 | 3,2 | |||
| 0.001M biotin løsning (μl) | 0,8 | 2 | 4 |
Tabel 3. Biotinylation af RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at kunne bruge mikropipette vedhæftning frekvens-analysen bør man overveje en række vigtige skridt. Først skal du sørge for at registrere den specifikke interaktion for den receptor-ligand system af interesse. Uspecifik kontrolmålinger (jf. fig. 3, 4) sikre, at specificitet. Ideelt set bør uspecifik vedhæftning sandsynligheder være under 0,05 for al kontakt tid, varighed og til at have en betydelig forskel mellem det specifikke og uspecifikke vedhæftning sandsynligheder for hvert tidspunkt. Forskellige metoder kan bruges til at koble ligander til RBC overfladen. Det viste sig, at chrom chlorid kobling metode 17 gav en højere grad af uspecifik binding end biotin-streptavidin kobling.
For det andet bør en vedhæftning sandsynligheden for specifikke interaktion være i midten rækkevidde. Dette krav kan opfyldes ved at variere tætheder af receptorer og ligander (eller kun ligander på RBC, hvis receptorer konstitutivt udtrykkes på celles tæthed, som er svært at ændre). Til dette formål, man tester et nyt system med ukendt receptor-ligand affinitet forberede en række biotinyleret RBC (se tabel III som et eksempel) til at teste en bred vifte af ligand tætheder. Steady-state vedhæftning sandsynlighed bør ikke være mere end 0,8 i gennemsnit i celle-til-celle receptor densitet variation normalt bringer vedhæftning niveau af nogle celler til 1, hvis den gennemsnitlige liganden tæthed er for høj. Under indledende test for specificitet, hvis nogle celler har vedhæftning på 0 eller 1 liganden tæthed skal justeres. Uspecifik kontrolmålinger normalt følge de specifikke mål, og her må man gerne vil have vedhæftning sandsynlighed så tæt på nul som muligt.
For det tredje, finde det rigtige område for kontakten gange. Hvis kontakten er lang nok, exp (- k off t) sigt i Eq. 1 går til nul, og den effektive 2D affinitet kan beregnes ud fra plateauet niveauaf vedhæftning kurve 1: 
Den off-sats k off bestemmer overgangsfasen, eller hvor hurtigt vedhæftningen kurve når til et plateau niveau. For at estimere off-sats præcist kræver målinger af flere punkter på et plateau niveau samt tid nok point i overgangsfasen. Regnskab for de tre kritiske trin, der er beskrevet ovenfor, vil man opnå bindende kurver svarende til Fig. 4.
Den resterende opgave er at bruge en receptor-ligand binding kinetikken model til at fortolke den eksperimentelt målte bindende kurve og til vurdering af 2D kinetiske parametre fra Modeltilpasnings forudsigelse til dataene. Det skal bemærkes, at Eq. 1 repræsenterer en enkleste model af anden orden frem, første ordens omvendt, single-step, reversibel kinetik mellem en enkelt receptor-ligand arter 1. Mere komplekse kinetiske processer er blevet beskrevet, herunder the tilfælde af dobbelt receptor-ligand arter 3,4, to-trins bindende uden 14 eller med 19 trimolecular interaktioner, og vedhæftning kinetik begrænset af aktive site dannelse i stedet for obligationer kinetik 10. I disse tilfælde er mere involveret matematiske modeller, der kræves for at relatere vedhæftning sandsynligheden vs kontakt tidskurven og receptor-ligand binding kinetik.
Den fortsatte interesse i kinetikken af receptor-ligand interaktion stammer fra den grundlæggende hypotese, at kinetik parametre spiller en rolle ved fastsættelsen af downstream signalering begivenheder inde i cellen. Den mikropipette vedhæftning frekvens-analysen præsenteres her, er en af de meget få metoder, der tillader in situ målinger af den todimensionale (2D) bindende kinetik. To-dimensionelle betyder, at både receptorer og ligander er på celleoverfladerne, som forekommer naturligt i mange celle-celle interaktioner inde i organismen. 2D kinetiske hastighedskonstanter af receptor-Ligog bindende fremskaffe oplysninger til, hvor hurtigt celler binder sig til hinanden eller til den ekstracellulære matrix, hvor længe de fortsat er bundet, og hvor mange obligationer vil form. Til sammenligning, 23 en af de interagerende molekyler i overfladen plasmon resonans (SPR)-metoden er i den flydende fase, og derfor kaldes tredimensionale (3D) bindende. Fordi begge interagerende molekyler er renset og isoleret fra det cellulære miljø, kunne de kinetiske parametre opnået i 3D måling drastisk anderledes end dem, der opnås i 2D-målinger, selv for den samme receptor-ligand par 17.
Vedhæftningen frekvens Metoden analyser 2D kinetik på levende celle membranen og dermed giver mulighed for én til at analysere biofysiske og biokemiske bestemmelser i den cellulære miljø. Disse omfatter membranen microtopology 5, membran anker 2, molekylære orientering og længde 6, transportør stivhed 9 og CurvaTure 20, impingement kraft 20, og modulatorer af cytoskeleton og membran organisation, hvor de interagerende molekyler bor 15,17.
Fordi tværs Junctional receptor-ligand samspil kræver direkte fysisk kontakt mellem to celler og resulterer i fysiske kobling mellem to celler, kan den kemiske reaktionskinetik af molekylære interaktion blive analyseret af en mekanisk analyse, der sætter cellerne i kontakt og registrerer bindende ved effekten af magt. Selvom vi eksemplificeret vedhæftningen frekvens analysen ved hjælp af en mikropipette-indsugning RBC som en vedhæftning sensor, kan andre tvinge teknikker skal anvendes, herunder atomic force mikroskopi 24, biomembrane kraft sonde -8,17, optisk pincet 25, og den integrerede mikropipette og cantilever 26.
Andre mekanisk-baseret 2D assays er blevet udviklet. Disse omfatter termiske udsving analysen 8, centrifugeringtion assay 27,28, rosetting assay 29, og flow kammer assay 30,31.
Begrænsningen af vedhæftningen frekvens analysen er den langsomme og arbejdskraftintensive karakter af analysen på grund af de gentagne serielle cykler med et enkelt par af celler testes én kontakt ad gangen. Det bliver svært for receptor-ligand interaktioner med langsomme off-kurser, fordi længerevarende kontakt gange ville være nødvendig for bindingen kurven for at nå steady-state, hvilket gør eksperimentet inhibitively lang.
Den krafttransducer konstrueret af en mikropipette-indsugning RBC er i stand til at afsløre piconewton-niveau kræfter, som er en størrelsesorden lavere end den typiske styrken af et noncovalent receptor-ligand obligation 1,32. Men receptor-ligand dissociation kan forekomme selv ved nul kræfter. Enhver svag vedhæftning, der går ubemærket fører til en undervurdering af bindingsaffinitet og on-rente 1.
Than vedhæftning frekvens metode forudsætter, at hver vedhæftning testen er identisk og uafhængigt af de andre. Dette krav kunne være overtrådt, som blev vist for nogle systemer 33, hvor den nuværende vedhæftning øges eller mindskes sandsynligheden for det næste vedhæftning. Det Matlab kode for at kontrollere, hvis kravet er opfyldt for den registrerede sekvens af friktion begivenheder er til rådighed efter anmodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af NIH tilskud R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343, og R01GM096187.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD Biosciences | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport Corp. | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piez–lectric translator | Physik Instruments | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetic Systems | 5200 Series | Micropipette system |
References
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
- Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
- Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
- Huang, J. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
- Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
- Wu, L. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
- Waugh, R. E., Lomakina, E. B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
- Zhang, F. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
- Lomakina, E. B., Waugh, R. E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
- Chien, Y. H. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
- Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
- Wasserman, H. A. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
- Huang, J. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 Forthcoming.
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
- Jiang, N. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
- Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
- Zhu, C., Williams, T. E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
- Downey, G. P. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
- Li, P. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
- Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
- Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
- Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
- Long, M. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
- Lou, J. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
- Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
- Evans, E., Berk, D., Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
- Zarnitsyna, V. I. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).
