Summary
En vedheft frekvens assay for måling av reseptor-ligand interaksjoner kinetikk når begge molekyler er forankret på overflater av vekselvirkende cellene er beskrevet. Denne mekanisk-baserte analysen er eksemplifisert ved hjelp av en mikropipette-trykksatt human røde blodceller som vedheft sensor og integrin αLβ2 og intercellulær adhesjonsmolekyl-1 som samspill reseptorer og ligander.
Abstract
Den mikropipette vedheft analysen ble utviklet i 1998 for å måle to-dimensjonale (2D) reseptor-ligand binding kinetikk 1. Analysen bruker en menneskelig røde blodlegemer (RBC) som vedheft sensor og presentere celle for en av de vekselvirkende molekyler. Det sysselsetter mikromanipulasjonsprosedyre å bringe RBC i kontakt med en annen celle som uttrykker den andre samspill molekylet med presist kontrollert område og tid for å muliggjøre bindingen formasjon. Vedheft hendelse er oppdaget som RBC forlengelse på å trekke de to cellene fra hverandre. Ved å kontrollere tettheten av ligander immobilisert på RBC overflaten, er sannsynligheten for vedheft holdt i mid-range mellom 0 og 1. Vedheft Sannsynligheten er beregnet fra hyppigheten av vedheft hendelser i en sekvens av gjentatt kontakt sykluser mellom de to cellene for en gitt kontakt tid. Varierende kontakten tiden genererer en bindende kurve. Fitting en sannsynlighets modell for reseptor-ligand reaksjonskinetikk 1 til bindendekurve returnerer 2D affinitet og off-rate.
Analysen har blitt validert ved hjelp av interaksjoner av Fcγ reseptorer med IgG 1-6 Fc, selectins med glycoconjugate ligander 6-9, integriner med ligander 10-13, homotypical cadherin 14 binding, T-celle reseptor og coreceptor med peptid-dur histocompatibility komplekser 15 - 19.
Metoden har vært brukt til å kvantifisere reguleringer av 2D kinetikk ved biofysiske faktorer, som membranen microtopology 5, membran anker 2, molekylær orientering og 6 lengde, carrier stivhet 9, kurvatur 20, og impingement force 20, samt biokjemiske faktorer, slik som modulatorer av cytoskjelettet og membran mikromiljøet hvor samspill molekyler bor og overflaten organiseringen av disse molekylene 15,17,19.
Metoden har også blitt brukt to studere samtidig binding av dual reseptor-ligand arter 3,4, og trimolecular interaksjoner 19 ved hjelp av en modifisert modell 21.
Den store fordelen med metoden er at det tillater studier av reseptorer i sitt eget membran miljø. Resultatene kan være svært forskjellig fra de som ble oppnådd ved hjelp av renset reseptorer 17. Den tillater også studier av reseptor-ligand interaksjoner i en sub-sekunders tidsskala med temporal oppløsning langt utover typiske biokjemiske metoder.
For å illustrere mikropipette vedheft frekvens metoden, viser vi kinetikk måling av intercellulær adhesjonsmolekyl 1 (ICAM-1) functionalized på RBCs binding til integrin α L β 2 på nøytrofile med dimeric E-selektin i løsningen for å aktivere α L β 2.
Protocol
1. RBCs isolasjon fra fullblod
- Forbered EAS-45 løsninger. Vei opp alle ingredienser fra tabell I og oppløses i 100-200ml av DI vann. Tilsett vann til å gjøre 1000ml løsning og juster pH til 8,0. Filter og delmengde av 50ml. Fryses ved -20 ° C for lagring.
Merk: Step 1.2 skal utføres av en utdannet medisinsk faglig som for eksempel en sykepleier, med en Institutional Review Board godkjent protokollen.
- Tegn 3-5ml av blod fra median cubital vein inn i en 10 ml tube inneholder EDTA og forsiktig blande blodet med EDTA umiddelbart og grundig for å unngå blodpropp.
- Process blodprøve så snart som mulig. Alle de følgende trinn bortsett sentrifugering bør gjøres under panseret for å holde forberedelse sterile. Overfør blodet til en 50ml sentrifugerør, legge 10ml av kalde og sterile Histopaque 1077 og sentrifuger for 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Gjenta to ganger.
- Legge til 10ml kald og steril PBS, sentrifuger for 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Fjern supernatanten. Gjenta 4 ganger (totalt 5 ganger).
- Vask med sterilt EAS-45 (5min @ 1000rpm, 4 ° C) to ganger. I løpet av siste vask flytte RBCs inn i en ny steril 15ml tube.
- Resuspender RBCs in10ml EAS-45.
2. RBCs biotinylation
- Ta røret med RBCs fra trinn 1. Fjern alle supernatanten etter sentrifugering for 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Sett 10μl av RBCs pellet til hver av flere ampuller og legge tilsvarende mengde PBS til hvert hetteglass (se tabell II for eksempel utarbeidelse av seks forskjellige RBCs biotinylation konsentrasjoner).
- Lag friske Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 fortynninger etter tabell II.
- Legg 10μl av 0.1m borat buffer til hvert hetteglass.
- Legg beregnet mengde biotin løsning til hvert hetteglass (se tabell II som eksempel) og vortex umiddelbart.
- Plasser hver RBC hetteglassinne i et 50ml konisk rør og inkuber på rotator for 30min ved romtemperatur.
- Vask hvert hetteglass 3 ganger med 800μl av EAS-45 for 2min @ 2000rpm.
- Legg 100μl av EAS-45 til hvert hetteglass og oppbevar ved 4 ° C. I hvert 1μl av den endelige løsningen nå skal være ~ 1mln av RBCs.
3. Functionalizing den biotin-linked ligander * på RBCs
- Forbered 2mg/ml streptavidin løsning i henhold til produsentens anvisninger. Aliqouted løsning kan lagres ved -20 ° C.
- Bland en lik mengde RBCs fra trinn 2,7 (10μl) med streptavidin løsning, vortex umiddelbart og inkuber på rotator for 30min ved 4 ° C.
- Vask 3 ganger med 500μl av EAS-45 for 2min @ 2000rpm. Legg 15μl EAS-45 / 1% BSA for lagring.
- Mix lik mengde RBCs fra trinn 3,3 (10μl) med 20μg/ml ligand løsning, vortex umiddelbart og inkuber på rotator for 30min ved romtemperatur.
- Vask to ganger med 500μl av EAS-45 / 1% BSA for 2min @ 2000rpm. Legg 15μl av EAS-45 / 1% BSA for lagring.
* Hvis proteinet har ingen biotin lenker du kan bruke en av de kommersielt tilgjengelige kits for protein biotinylation (for eksempel Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation Kit) eller bruk biotinylert fange antistoffer som et mellomliggende trinn som vist i videoen.
Fire. Kvantifisering av reseptor og ligand tettheter
- Inkuber ligand-belagt RBCs fra trinn 3 og, i en annen hetteglass, reseptor-bærende celler med saturating konsentrasjoner av respektive mAbs for 30min ved romtemperatur. Inkuber i separate hetteglass celler med irrelevant isotype-matchet antistoffer for kontroll. Hvis den primære antistoffene ikke er fluorescensmerkede, inkuber med fluorescensmerket-konjugert sekundære antistoffer i henhold til produsentens anvisninger.
- Analysere prøver avlagt i steg 4,1 med flow cytometery med tilsvarende fluorescerende calibration perler. Beregn tettheter som vist i fig. 1.
5. Forberedelse til mikropipette og celle kammer
- Trekk mikropipetter fra kapillarrør bruke PN-30 Narishige 'Magnetic Glass Microelectrode Horisontal Puller eller Sutter Instruments mikropipette Puller.
- Bruk micromanipulator med microforge å justere tuppen av trukket mikropipette til ønsket størrelse (vanligvis nødvendig diameter varierer fra 1-5μm avhengig av størrelsen av cellene som skal brukes i studien).
- Forbered cellen kammeret ved å kutte mikroskop Cover Glass til ønsket størrelse. Seal kammeret bruker Mineral Oil fra begge sider for å unngå medium fordampning å endre osmolaritet under forsøket.
- Legg til reseptor-og ligand-bærende celler til kammeret.
Seks. Mikropipette vedheft frekvens assay
- Aspirer samspill celler ved respektive pipetter og bruke datamaskin programmert piezoelectr ic oversetter å drive RBC inn og ut av kontakten med den andre cellen med kontrollert kontakt område og tid. Detect vedheft hendelser ved å observere RBC forlengelse på celle separasjon.
- Gjenta kontakt-retraction syklus 50-100 ganger for en gitt kontakt tid. Record observert vedheft hendelsene ved å legge til "1" for vedheft eller "0" for ingen vedheft i en kolonne i Excel regneark. Du kan bruke en innspilling enhet, for eksempel digitale medier eller videobånd, for de mikroskopiske bilder.
- Noter vedheft frekvens versus kontakt tidskurven bruker minst tre forskjellige celle parvis for hver kontakt på tide å få en middelverdi og SEM.
- Noter ikke-spesifikk binding kurven for kontroll ved hjelp RBCs belagt med irrelevante ligander (f.eks BSA) og / eller blokkerer ligandene eller reseptorer bruker deres spesifikke funksjonelle blokade mAbs. Spesifikke vedheft frekvens på hvert kontakt tidspunkt kan beregnes ved fjerning av uspesifikk adhesjon frekvens 1.
- Monter spesifikke vedheft frekvens P ett versus kontakt tid t data av en statistisk modell (formel 1) som beskriver en andre-ordens fremover og første-ordens revers, single-steg interaksjon mellom en enkelt art av reseptorer og en enkelt art av ligander 1 :
der K a er 2D effektiv bindingsaffinitet, k off er off-rate, m r og m l er de respektive reseptor og ligand tettheter målt i trinn 4, og A c er kontakten området. Kurven-fit har to parametre, A c K a og k off, som A c og K en er lumped sammen og kalt kollektivt så effektiv 2D affinitet. Sitt produkt med off-rate er effektiv 2D on-rate: A c k på = A c K a x k off.
De spesifikke adhesjon frekvens P a er beregnet ved subtraksjon av uspesifikk adhesjon brøkdel (P uspesifikke) fra total målt vedheft (P målt) 1,21:
8. Representant Resultater:
Figur 1 Bestemmelse av integrin α L β 2 nettstedet tetthet på nøytrofile. Nøytrofile ble først inkubert med 1μg/ml av E-selektin-Ig for 10min for å matche den eksperimentelle tilstanden brukt i figurene 3,4 eller uten E-selektin-Ig, og deretter med saturating konsentrasjoner (10μg/ml) av PE-konjugert anti -human CD11a MAB (Clone HI111, se tabell av spesifikkereagenser og utstyr) eller irrelevant mus IgG1 for kontroll, vasket, og analyseres umiddelbart. Prøvene ble lest på BD LSR flowcytometeret med standard QuantiBRITE PE kalibrering perler. Panel A viser fluorescens histogrammer av Kalibreringsperler (rosa) sammen med de av E-selektin-Ig behandlet (blå farge) eller ubehandlet celler (grønn farge). Spesifikk CD11a MAB farging er vist i solid kurver og irrelevant isotype-matchet kontroll antistoff farging er vist i stiplet kurver. Celler behandlet med E-selektin-Ig (tilstedeværelse i alle vaske trapper og i FACS buffer) påvirket ikke CD11a tetthet sett fra sammenligning med ubehandlet celler. Panel B viser prosessen med tetthet kvantifisering. Log10 ble beregnet for gjennomsnittlig fluorescerende intensitet (FI) av hver peak verdi av fire kalibrering perle histogrammer fra Panel A (rosa sirkler) og for mye-spesifikke PE molekyler per perle (fra produsenten). En lineær regresjon av LOG10 PE molekyler per perle mot log10 fluorescstor forskjell var plottet. For E-selektin behandlede celler LOG10 FI (y) verdier lik 3,99 (blå solid sirkel) og 2,23 (blå åpen sirkel) for spesifikke MAB og kontroll antistoff, respectivly. Vi løste lineære ligningen for x (verdier plottes som grønn og blå sirkler på Panel B) x = log10 PE / celle, og som PE. MAB forholdet 1:1, var det totale antall α L β 2 på nøytrofile beregnes som 9587. Surface tettheten ble beregnet å være 43 molekyler / mikrometer 2, bruke 8.4μm som nøytrofile diameter 22. Tetthet av ICAM-1 ble tilsvarende målt med flow cytometery bruke PE-anti-human CD54 MAB, noe som tilsvarte 65 mol / mikrometer 2.
Figur 2 mikropipette system schematics. Vårt mikropipette Systemet ble montert i huset og består av tre delsystemer: en avbildning delsystem å tillate en å observere, record og analysere bevegelser mikropipette pustende celle, en mikromanipulasjonsprosedyre delsystem for å aktivere en å velge celler fra cellen kammer, og et trykk delsystem for å tillate en til Aspirer cellene inn mikropipetter. Den sentrale del av bildebehandling delsystemet er invertert mikroskop (Olympus IMT-2 IMT2) med en 100x olje nedsenking 1,25 NA mål. Bildet sendes til en video kassett opptaker gjennom en kostnad par enhet (CCD) kamera. En video timer er koblet til systemet for å holde orden på tid. Hver mikropipette kan manipuleres av en mekanisk drive montert på mikroskopet og fint plassert med en tre-akse hydrauliske micromanipulator. Mekanisk manipulatorer fra Newport kunne brukes i tillegg. En av mikropipette eierne er montert på en piezoelektrisk oversetter, er sjåføren som styres av en datamaskin LabView kode (tilgjengelig på forespørsel) og signalet oversetter gjennom en DAQ styre via en spenningsforsterker (hjemmelaget) til piezo aktuatoren. Dette er enllows en å flytte pipette presist og repeatably i en vedheft test syklus. Trykket regulering subsystem brukes til å kontrollere sug under forsøket. En hydraulisk linje forbinder mikropipette innehaveren til en væske reservoaret. En fin mekanisk positioner gjør at høyden på reservoaret for å være nøyaktig manipulert.
Mikropipetter er generert ved hjelp KIMAX smeltepunkt borsilikatglass kapillarrør (med utvendig diameter på 1,0 ± 0.07 mm og en innvendig diameter på 0,7 ± 0.07 mm. Først blir mikropipetter fra kapillarrør trekkes bruke PN-30 Narishige 'Magnetic Glass Microelectrode Horisontal Puller (Sutter Instruments mikropipette Puller er et annet puller alternativet). Second, Microforge system (bygd i huset) brukes til å kutte mikropipetter til ønsket størrelse åpning. Commercial modeller av Microforge systemer er også tilgjengelig.
For å unngå vibrasjoner i mikropipetter under forsøket, den microscope, sammen med micromanipulators, er plassert på en luftfjæring bord.
Figur 3 Running vedheft frekvens F i for spesifikke (A) og spesifikk (B) binding på 1s (rød) og 10s (blå) kontakt ganger målt fra gjentatte vedheft testsykluser mellom RBCs belagt med ICAM-1 (A) eller hIgG (B ) med menneskelige nøytrofile uttrykke integrin α L β 2. F i = (X 1 + X 2 + ... + X i) / i (1 ≤ i ≤ n), der jeg er testen syklus indeks, X i likemenn "1" (adhesjon) eller "0" (ingen heft). F n (n = 50) ble benyttet som beste estimat for vedheft sannsynlighet.
Figur 4 Kinetics avICAM-1 binding til nøytrofile integrin α L β 2 ( 
). Heft sannsynlighet målt som vist i Figur 3 for tre cellers par på hver kontakt tiden er gjennomsnitt og plottes versus kontakttid. Kammeret medium var HBSS med 1mm hver av Ca 2 + og Mg 2 + pluss 1μg/ml av dimeric E-selektin-Ig å upregulate α L β 2 binding. For å fange ICAM-1-Ig på RBCs, et mellomliggende trinn ble lagt ruge RBCs med 10μg/ml fange antistoff (biotinylert goat-anti-menneskelige Fc antistoff, eBioscience) etter streptavidin inkubasjon trinn. Å kontrollere for ikke-spesifikk binding to forskjellige tilstander ble brukt: 1) RBCs belagt med anti-human-Fc fange antistoff og inkubert med humant IgG istedenfor ICAM-1-Ig (O) og 2) nøytrofile binding til RBCs ikke belagt med fange antistoff (Δ). 10μg/ml human IgG ble lagt til mediet for å minimalisere binding av E-Selektin-Ig i løsningen til fange antistoffet på RBC overflaten. Ikke-spesifikk binding registrert som human IgG kontroll kurven ble brukt for å oppnå en bestemt heft sannsynlighet kurve ( 
) Ved hjelp Eq. 2. Montering spesifikke adhesjon sannsynlighet kurve med Eq. 1 (heltrukket linje) returnerte effektiv bindingsaffinitet A c K a = 1,4 • 10 -4 μm4 og k off = 0,3 s -1.
| Reagens | MW (g / mol) | Konsentrasjon (mM) | Mengde (g) |
|---|---|---|---|
| Adenin | 135,13 | 2 | 0,27 |
| D-glukose (druesukker) | 180,16 | 110 | 19.82 |
| D-Mannitol | 182,17 | 55 | 10.02 |
| Natriumklorid (NaCl) | 58.44 | 50 | 2,92 |
| Natriumfosfat, Dibasic (Na HPO ) | 141,95 | 20 | 2,84 |
| L-glutamin | 146,15 | 10 | 1,46 |
Tabell 1. EAS-45 buffer forberedelse (1L).
| 25 mg biotin-XHS i 550 mL av DMF | 0.1m biotin løsning |
| 01:10 fortynning på 0,1 biotin w / DMF | 0.01M biotin løsning |
| 1:100 fortynning på 0,1 biotin w / DMF | 0.001M biotin løsning |
Tabell 2. Forberedelse av biotin løsningen.
| biotin endelig konsentrasjon (mM) | 4 | 10 | 20 | 50 | 100 | 160 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| RBCs pellet lager (mL) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1x PBS (mL) | 179,2 | 178 | 176 | 179 | 178 | 176,8 |
| 0.1m borat buffer (mL) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 0.01M biotin løsning (mL) | 1 | 2 | 3.2 | |||
| 0.001M biotin løsning (mL) | 0.8 | 2 | 4 |
Tabell 3. Biotinylation av RBCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å kunne bruke mikropipette vedheft frekvens analysen bør man vurdere flere kritiske trinn. Først, sørg for å registrere spesifikke interaksjonsstudier for reseptor-ligand system av interesse. Uspesifikke kontroll målinger (jf. fig. 3, 4) sikre spesifisitet. Ideelt sett bør uspesifikk adhesjon sannsynligheter være under 0,05 for all kontakt tid varigheter og å ha en signifikant forskjell mellom de spesifikke og uspesifikke vedheft sannsynligheter for hvert tidspunkt. Ulike metoder kan brukes til å feste ligander til RBCs overflaten. Det ble vist at krom klorid kopling metode 17 ga et høyere nivå av ikke-spesifikk binding enn biotin-streptavidin kobling.
Dernest bør en vedheft sannsynlighet for spesifikke interaksjon være i midten rekkevidde. Dette kravet kan oppfylles ved å variere tettheten av reseptorer og ligander (eller bare ligander på RBCs hvis reseptorer er konstitutivt uttrykt på celleer den tetthet som er vanskelig å endre). For dette formålet, når jeg tester et nytt system med ukjent reseptor-ligand binding affinitet, utarbeide en rekke biotinylert RBCs (se tabell III som et eksempel) for å teste et utvalg av ligand tettheter. Steady-state heft sannsynlighet bør ikke være mer enn 0,8 i snitt som celle-til-celle reseptor tetthet variasjon vanligvis bringer vedheft nivået av noen celler til 1 dersom gjennomsnittlig ligand tettheten er for høy. Under innledende testing for spesifisitet, hvis noen celler har vedheft nivåer av 0 eller 1, må ligand tettheten som skal justeres. Uspesifikke kontroll målinger vanligvis følge de spesifikke målinger og her man ønsker å ha vedheft sannsynlighet så nær null som mulig.
Tredje, finne den riktige området for kontakten ganger. Dersom kontakten er lang nok til exp (- k off t) term i Eq. 1 går til null og effektiv 2D affinitet kan beregnes fra platåav vedheft kurve 1: 
Den off-rate k bestemmer off overgangsfasen eller hvor raskt vedheft kurven kommer til et platå. Å estimere off-rate krever nøyaktig måling av flere punkter på et platå samt nok tid punkter i overgangsfasen. Regnskap for de tre kritiske trinnene som er beskrevet ovenfor, vil man oppnå binding kurver lik fig. Fire.
De resterende oppgave er å bruke en reseptor-ligand binding kinetikk modell for å tolke den eksperimentelt målte binding kurve og beregne av 2D kinetiske parametere fra montering modellen prediksjon til dataene. Det bør bemerkes at Eq. 1 representerer en enkleste modell av andre-ordens fremover, første orden revers, single-trinn, reversible kinetikk mellom en enkelt reseptor-ligand arter 1. Mer komplekse kinetiske prosesser har blitt beskrevet, inkludert the tilfeller av dual reseptor-ligand arter 3,4, to-trinns binding uten 14 eller med 19 trimolecular interaksjoner, og heft kinetikk begrenset av aktive området dannelsen istedenfor bånd kinetikk 10. I disse tilfellene er mer involvert matematiske modeller som kreves for å relatere vedheft sannsynligheten vs kontakt tidskurven og reseptor-ligand binding kinetikk.
Den vedvarende interesse i kinetikken av reseptor-ligand interaksjon stammer fra den grunnleggende hypotesen om at kinetikken parametere spille en rolle i å bestemme nedstrøms signalering hendelsene inne i cellen. Den mikropipette vedheft frekvens analysen som presenteres her er en av svært få metoder som tillater in situ målinger av de to-dimensjonale (2D) binding kinetikk. To-dimensjonal betyr at både reseptorer og ligander er på celleoverflaten, som naturlig forekommer i mange celle-celle interaksjoner inne i organismen. 2D kinetiske hastighetskonstanter av reseptor-LIGog forpliktende gi informasjon om hvor raskt cellene binder seg til hverandre eller til ekstracellulær matrix, hvor lenge de forblir bundet, og hvor mange obligasjoner vil danne. Til sammenligning, i Surface Plasmon Resonans (SPR)-metoden 23 en av samspill molekylene er i flytende fase, derav kalt tredimensjonale (3D) bindende. Fordi begge samspill molekyler er renset og isolert fra den cellulære miljøet, kan den kinetiske parametre oppnådd i 3D-måling være drastisk forskjellig fra de som ble oppnådd i 2D målinger selv for den samme reseptor-ligand par 17.
Vedheft frekvens metoden analyserer 2D kinetikk på levende cellemembranen og dermed gir en mulighet for en å analysere biofysiske og biokjemiske forskrifter cellular miljøet. Disse inkluderer membranen microtopology 5, membran anker 2, molekylær orientering og lengde 6, carrier stivhet 9 og Curva20 temperatur, impingement kraft 20, og modulatorer av cytoskjelettet og membran organisasjon hvor samspill molekyler bor 15,17.
Fordi cross-junctional reseptor-ligand interaksjon krever direkte fysisk kontakt mellom to celler og resulterer i fysisk kobling mellom to celler, kan kjemisk reaksjonskinetikk av molekylær interaksjon bli analysert av en mekanisk analyse som setter cellene i kontakt og oppdager binding av effekten av makt. Selv om vi eksemplifisert vedheft frekvens analysen ved hjelp av en mikropipette pustende RBC som vedheft sensor, kan andre tvinge teknikker brukes, inkludert atomic force mikroskopi 24, biomembrane force 8,17 probe, optiske pinsetter 25, og den integrerte mikropipette og cantilever 26.
Andre mekanisk-baserte 2D-analyser har blitt utviklet. Disse inkluderer termiske svingninger analysen 8, centrifugasjon analysen 27,28, rosetting 29 analysen, og flyt chamber analysen 30,31.
Begrensningen til vedheft frekvens analysen er langsom og arbeidskrevende natur analysen på grunn av gjentatte seriell sykluser med et enkelt par av celler testet én kontakt om gangen. Det blir vanskelig for reseptor-ligand interaksjoner med slow off-kurser ettersom lang kontakt tider ville være nødvendig for bindingen kurven for å nå steady-state, noe som gjør eksperimentet inhibitively lang.
Kraften svinger konstruert av en mikropipette pustende RBC er i stand til å oppdage piconewton nivå krefter, som er en størrelsesorden lavere enn den typiske styrken til en noncovalent reseptor-ligand obligasjon 1,32. Men reseptor-ligand dissosiasjon kan forekomme selv ved null krefter. Eventuelle svake vedheft som går uoppdaget fører til en undervurdering av den bindende affinitet og rente 1.
Than vedheft frekvens metoden forutsetter at hver vedheft testen er identisk og uavhengig fra de andre. Dette kravet kan bli krenket som ble vist for noen 33 systemer, hvor nåværende vedheft økt eller redusert sannsynligheten for det neste vedheft. I Matlab-kode for å sjekke om kravet er oppfylt for den registrerte sekvensen av vedheft hendelser er tilgjengelig på forespørsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av NIH stipend R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343, og R01GM096187.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD Biosciences | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport Corp. | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piez–lectric translator | Physik Instruments | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetic Systems | 5200 Series | Micropipette system |
References
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
- Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
- Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
- Huang, J. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
- Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
- Wu, L. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
- Waugh, R. E., Lomakina, E. B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
- Zhang, F. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
- Lomakina, E. B., Waugh, R. E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
- Chien, Y. H. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
- Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
- Wasserman, H. A. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
- Huang, J. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 Forthcoming.
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
- Jiang, N. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
- Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
- Zhu, C., Williams, T. E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
- Downey, G. P. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
- Li, P. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
- Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
- Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
- Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
- Long, M. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
- Lou, J. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
- Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
- Evans, E., Berk, D., Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
- Zarnitsyna, V. I. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).
