Summary
Eine Haftung Frequenz-Assay zur Messung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung Kinetik, wenn beide Moleküle auf der Oberfläche der interagierenden Zellen verankert sind beschrieben. Diese mechanisch-basierter Assay wird beispielhaft mit einer Mikropipette unter Druck menschlichen roten Blutkörperchen als Haftvermittler Sensor und Integrin αLβ2 und ICAM-1 als interagierende Rezeptoren und Liganden.
Abstract
Die Mikropipette Adhäsionsassay wurde 1998 entwickelt, um zweidimensionale (2D)-Rezeptor-Ligand-Bindung Kinetik 1 zu messen. Der Test verwendet eine menschliche rote Blutzellen (RBC) als Haftvermittler Sensor und präsentierenden Zelle für eine der wechselwirkenden Moleküle. Das Unternehmen beschäftigt Mikromanipulation der RBC in Kontakt mit einer anderen Zelle, dass die anderen interagieren Molekül drückt mit präzise kontrollierten Raum und Zeit, um Bindung zu ermöglichen bringen. Die Haftung Veranstaltung ist als RBC Dehnung beim Ziehen der beiden Zellen voneinander entdeckt. Durch die Steuerung der Dichte des Liganden auf der RBC Oberfläche immobilisiert, ist die Wahrscheinlichkeit der Adhäsion in Mid-Range zwischen 0 und 1 gehalten. Die Haftung Wahrscheinlichkeit ist von der Frequenz der Haftung Ereignisse in eine Folge von wiederholtem Kontakt Zyklen zwischen den beiden Zellen für eine bestimmte Einwirkzeit geschätzt. Durch Variation der Einwirkzeit erzeugt eine verbindliche Kurve. Der Einbau einer probabilistischen Modell für die Rezeptor-Ligand-Reaktionskinetik 1, um die BindungKurve gibt die 2D-Affinität und off-Rate.
Der Test wurde validiert mit Wechselwirkungen von Fcy Rezeptoren mit IgG Fc 1-6, Selektine mit Glykokonjugat Liganden 6-9, Integrine mit Liganden 10-13, homotypical Cadherin binden 14, T-Zell-Rezeptor und Korezeptor mit Peptid-MHC-Komplexe 15 - 19.
Die Methode wurde verwendet, um Vorschriften von 2D-Kinetik von biophysikalischen Faktoren, wie die Membran microtopology 5, Membrananker 2, molekulare Orientierung und Länge 6, Träger Steifigkeit 9, Krümmung 20 und Impingement Kraft 20, sowie biochemische Faktoren zu quantifizieren, wie Modulatoren des Zytoskeletts und Membranmikroumgebung wo die interagierende Moleküle befinden und die Oberfläche Organisation dieser Moleküle 15,17,19.
Die Methode wurde auch t verwendeto Studie der gleichzeitigen Bindung von zwei Rezeptor-Ligand-Arten 3,4 und trimolekulare Interaktionen 19 mit einem modifizierten Modell 21.
Der große Vorteil der Methode ist, dass es zu studieren von Rezeptoren in ihrer Muttersprache Membran-Umgebung ermöglicht. Die Ergebnisse könnten erheblich von denen unter Verwendung gereinigter Rezeptoren 17. Es ermöglicht auch Erforschung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen in einem Sub-Sekunden-Zeitskala mit zeitlicher Auflösung die weit über die typischen biochemischen Methoden.
Zur Veranschaulichung der Mikropipette Haftung Frequenz-Methode zeigen wir, Kinetik Messung von ICAM 1 (ICAM-1) auf Erythrozyten Bindung an Integrin α L β 2 auf Neutrophilen mit dimeren E-Selektin in die Lösung α L β 2 aktivieren funktionalisiert.
Protocol
1. RBCs Isolierung aus Vollblut
- Bereiten Sie EAS-45-Lösungen. Wägen Sie alle Zutaten aus Tabelle I und lösen sich in 100-200ml VE-Wasser. Wasser hinzu, bis 1000ml Lösung zu machen und pH-Wert auf 8,0. Filter und Aliquot von 50ml. Einfrieren bei -20 ° C für die Lagerung.
Hinweis: Schritt 1.2 sollte durch einen geschulten Arzt, wie eine Krankenschwester durchgeführt werden, mit einem Institutional Review Board genehmigten Protokoll.
- Draw 3-5 ml Blut aus der V. mediana cubiti in eine 10ml Röhrchen mit EDTA und vorsichtig mischen das Blut mit EDTA sofort und gründlich zu vermeiden Blutgerinnung.
- Prozess Blutprobe so schnell wie möglich. Alle folgenden Schritte außer Zentrifugation sollte unter der Haube zu halten Vorbereitung sterile durchgeführt werden. Übertragen Sie die Blut zu einem 50ml Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 10 ml kalt und steril Histopaque 1077 und Zentrifuge für 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Zweimal wiederholen.
- Fügen Sie 10ml kalte und sterile PBS, Zentrifuge für 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die 4-mal (insgesamt 5 mal).
- Waschen mit sterilem EAS-45 (5min @ 1000rpm, 4 ° C) zweimal. In den letzten Waschen bewegen RBCs in eine neue sterile 15ml Tube.
- Resuspendieren RBCs in10ml EAS-45.
2. RBCs Biotinylierung
- Nehmen Sie den Schlauch mit Erythrozyten aus Schritt 1. Entfernen Sie alle Überstand nach Zentrifugation für 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Setzen Sie 10 &mgr; l von RBC Pellet jeweils mehrere Ampullen und fügen entsprechende Menge PBS in jedes Fläschchen (siehe Tabelle II zum Beispiel zur Herstellung von sechs verschiedenen RBCs Biotinylierung Konzentrationen).
- Machen Sie frische Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 Verdünnungen nach Tabelle II.
- Add 10 &mgr; l 0,1 M Boratpuffer in jedes Fläschchen.
- Hinzufügen des berechneten Menge an Biotin-Lösung in jedes Fläschchen (siehe Tabelle II als Beispiel) und Vortex sofort.
- Platzieren Sie jede RBC Fläschchenin einem 50ml konischen Rohr und inkubieren am Rotator für 30min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie jede Flasche 3-mal mit 800μl der EAS-45 für 2min @ 2000rpm.
- Add 100 &mgr; von EAS-45 auf jeder Flasche und lagern bei 4 ° C. In jedem 1μl der endgültigen Lösung sollte nun ~ 1mln von RBC werden.
3. Funktionalisierung der Biotin-linked-Liganden * auf RBCs
- Bereiten 2mg/ml Streptavidin-Lösung nach den Anweisungen des Herstellers. Aliqouted Lösung kann bei -20 ° C gelagert werden
- Mix eine gleiche Menge an roten Blutkörperchen von Schritt 2,7 (10 &mgr; l) mit Streptavidin-Lösung, Vortex sofort und inkubieren am Rotator für 30min bei 4 ° C.
- 3 x waschen mit 500μl der EAS-45 für 2min @ 2000rpm. Add 15μl EAS-45 / 1% BSA für die Lagerung.
- Mix gleiche Menge an roten Blutkörperchen von Schritt 3,3 (10 &mgr; l) mit 20μg/ml Ligand-Lösung, Vortex sofort und inkubieren am Rotator für 30min bei Raumtemperatur.
- Wash zweimal mit 500μl der EAS-45 / 1% BSA für 2min @ 2000rpm. Fügen Sie 15μl von EAS-45 / 1% BSA für die Lagerung.
* Wenn Ihr Protein hat keine Biotin Link können Sie eine der kommerziell erhältlichen Kits für Protein Biotinylierung (z. B. Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylierung Kit) oder biotinylierten Fänger-Antikörper, als Zwischenschritt, wie gezeigt in dem Video.
4. Die Quantifizierung von Rezeptor und Ligand Dichten
- Inkubieren Ligand-beschichteten Erythrozyten aus Schritt 3, und in ein anderes Gefäß, Rezeptor-tragenden Zellen mit sättigenden Konzentrationen der jeweiligen mAbs für 30min bei Raumtemperatur. Inkubieren in separaten Fläschchen Zellen mit irrelevanten Isotyp-Antikörper für die Steuerung. Wenn der primäre Antikörper nicht fluoreszenzmarkierten sind, mit Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper inkubieren nach den Anweisungen des Herstellers.
- Analysieren Sie die Proben in Schritt 4.1 von Flow cytometery zubereitet mit entsprechenden fluoreszierenden calibration Perlen. Berechnen Sie die Dichte wie in Abb. gezeigt. 1.
5. Vorbereitung für Mikropipette und Zellkammer
- Pull-Mikropipetten aus Kapillaren mit PN-30 Narishige 'Magnetic Glas-Mikroelektrode Horizontal Puller oder Sutter Instruments Micropipette Puller.
- Verwenden Sie Mikromanipulator mit microforge an der Spitze des gezogenen Mikropipette auf die gewünschte Größe (in der Regel den erforderlichen Durchmesser reicht von 1-5 um je nach Größe der Zellen in der Studie verwendet werden) einstellen.
- Bereiten Sie die Zelle Kammer, indem Mikroskop Deckglas auf die gewünschte Größe. Seal die Kammer mit Mineralöl von beiden Seiten bis mittlere Verdunstung zu vermeiden, um die Osmolarität während des Experiments ändern.
- Fügen Sie die Rezeptor-und Ligand-tragenden Zellen in die Kammer.
6. Micropipette Haftung Frequenz-Test
- Saugen Sie die interagierenden Zellen, die durch jeweilige Pipetten und Einsatz computer-programmierte piezoelectr ic Übersetzer der RBC in und aus dem Kontakt-Laufwerk mit der anderen Zelle mit kontrolliertem Kontakt Raum und Zeit. Detect Haftung Ereignisse durch die Beobachtung RBC Dehnung auf Zellseparation.
- Wiederholen Sie den Kontakt-Rückzug-Zyklus 50-100 mal für eine bestimmte Einwirkzeit. Notieren Sie sich die beobachteten Ereignisse Haftung durch den Zusatz "1" für die Adhäsion oder "0" für keine Haftung in eine Spalte der Excel-Tabelle. Sie können ein Aufnahmegerät, zB digitale Medien oder Videoband, für den mikroskopischen Bildern.
- Notieren Sie sich die Haftung Frequenz gegenüber Berührung Zeit-Kurve mit mindestens drei verschiedenen Zell-Paare für jeden Kontakt Zeit, um einen Mittelwert und SEM erhalten.
- Notieren Sie sich die unspezifische Bindung Kurve die Kontrolle über RBCs mit irrelevanten Liganden (zB BSA) und / oder Sperrung der Liganden oder Rezeptoren mit ihren spezifischen funktionellen Blockade mAbs beschichtet. Spezifische Haftung Frequenz bei jedem Kontakt Zeitpunkt kann durch Entfernen der unspezifischen Adhäsion Frequenz 1 berechnet werden.
- Setzen Sie die spezifische Adhäsion Frequenz P ein Vergleich Kontaktzeit t Daten von einem probabilistischen Modell (Gleichung 1), dass ein zweiter Ordnung nach vorne und erster Ordnung umzukehren, Single-Step-Interaktion zwischen einem einzelnen Arten von Rezeptoren und einer einzigen Art von Liganden 1 beschreibt :
wo K eine ist die 2D effektive Bindungsaffinität, k off ist die Off-Rate, sind m r und m l die jeweiligen Rezeptoren und Liganden Dichten in Schritt 4 gemessen und A c ist die Kontaktfläche. Die Kurve-fit hat zwei Parameter, A c K a und k off, wie A c und K a sind zusammengeworfen und als kollektiv als effektive 2D-Affinität. Sein Produkt mit dem off-Rate ist die effektive 2D on-rate: A c k on = A c K a x k off.
Die spezifische Adhäsion Frequenz P a wird durch Subtraktion der unspezifischen Adhäsion Fraktion (P unspezifische) aus der Summe gemessen Haftung (P gemessen) 1,21 berechnet:
8. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1: Bestimmung der Integrin α L β 2 Website Dichte auf Neutrophilen. Neutrophile wurden zunächst mit 1μg/ml von E-Selektin-Ig für 10min inkubiert, um die experimentellen Bedingungen in Zahlen 3,4 oder ohne E-Selektin-Ig verwendet übereinstimmen, und dann mit sättigenden Konzentrationen (10μg/ml) von PE-konjugierten anti -Mensch-CD11a mAb (Clone HI111, siehe Tabelle der spezifischenReagenzien und Geräte) oder irrelevant Maus IgG1 für die Steuerung, gewaschen und sofort analysiert. Die Proben wurden auf BD LSR Durchflusszytometer mit Standard QuantiBRITE PE Kalibrierung Perlen zu lesen. Panel A zeigt Fluoreszenz-Histogramme der Kalibrierung Perlen (rosa) zusammen mit denen von E-Selektin-Ig behandelt wurden (blaue Farbe) oder unbehandelten Zellen (grüne Farbe). Spezifische CD11a mAb Färbung ist in durchgezogenen Kurven und irrelevant Isotyp-Kontroll-Antikörper-Färbung ist gestrichelt dargestellten Kurven gezeigt. Zellen, die mit E-Selektin-Ig (Präsenz in allen Waschschritte und in FACS-Puffer) behandelt wurden, keinen Einfluss auf die CD11a Dichte wie aus dem Vergleich mit unbehandelten Zellen gesehen. Panel B zeigt den Prozess der Dichte Quantifizierung. Log10 wurde für die mittlere Fluoreszenzintensität (FI) der einzelnen Spitzenwert von vier Kalibrierung bead Histogramme von Panel berechnet A (rosa Kreise) und für die viel-spezifischen PE-Moleküle pro Perle (vom Hersteller). Eine lineare Regression von Log10 PE-Moleküle pro Perle gegen Log10 fluoreszENCE wurde aufgezeichnet. Für E-Selektin behandelten Zellen der Log10 FI (y)-Werte gleich 3,99 (blue solid Kreis) und 2,23 (blue offener Kreis) für spezifische mAb und Kontroll-Antikörper, respectivly. Wir lösten das lineare Gleichung für x (Werte sind als grüne und blaue Kreise auf Panel B dargestellt) x = log10 PE / Zelle und als PE:. MAb-Verhältnis war 1:1, war die Gesamtzahl der α L β 2 auf Neutrophilen berechnet als 9587. Flächendichte berechnet wurde auf 43 Moleküle / um 2, mit 8.4μm wie die neutrophilen Durchmesser 22. Dichte von ICAM-1 wurde in ähnlicher Weise durch flow cytometery mit PE-Anti-Human-CD54 mAb, die 65 mol / &mgr; m 2 erreicht gemessen.
Abbildung 2 Micropipette System Schaltpläne. Unsere Mikropipette wurde im Haus montiert und besteht aus drei Teilsystemen: ein bildgebendes Subsystem, damit man beobachten, record und analysieren Bewegungen der Mikropipette-Saugmotor Zelle, eine Mikromanipulation Subsystem, damit man die Zellen aus der Zelle Kammer zu wählen, und ein Druck-Subsystem, damit man die Zellen in Mikropipetten absaugen. Das zentrale Stück der Imaging-Subsystem Mikroskop invertiert (Olympus IMT-2 IMT2) mit einem 100x Öl-Immersion 1,25 NA Objektiv. Das Bild wird auf einem Videorecorder über eine Belastung Coupled Device (CCD)-Kamera gesendet werden. Ein Video-Timer ist mit dem System gekoppelt, den Überblick über Zeit zu halten. Jede Mikropipette kann durch einen mechanischen Antrieb auf das Mikroskop angebracht und fein mit einem Drei-Achsen-hydraulischen Mikromanipulator positioniert manipuliert werden. Mechanische Manipulatoren aus Newport könnte auch verwendet werden. Einer der Mikropipette Inhaber auf einem piezoelektrischen Übersetzer montiert ist, wird der Fahrer, die von einem Computer LabView-Code (auf Anfrage) und das Signal übersetzt durch eine DAQ-Karte über einen Spannungs-Verstärker (hausgemacht), um den Piezo-Aktuator gesteuert. Dies ist einSorgt dafür, man die Pipette exakt und reproduzierbar zu bewegen in einer Adhäsion Testzyklus. Die Druckregelung Subsystem wird verwendet, um Saug während des Experiments zu kontrollieren. Ein hydraulischer Linie verbindet die Mikropipette Halter mit einem Flüssigkeitsbehälter. Eine feine mechanische Stellungsregler ermöglicht die Höhe des Behälters genau manipuliert werden.
Mikropipetten werden mit Hilfe KIMAX Schmelzpunkt Borosilikatglas Kapillaren (mit einem Außendurchmesser von 1,0 ± 0,07 mm und einem Innendurchmesser von 0,7 ± 0,07 mm. Erstens, die Mikropipetten von Kapillaren gezogen werden mit PN-30 Narishige 'Magnetic Glas-Mikroelektrode Horizontal Puller (Sutter Instruments Micropipette Puller ist ein weiterer Puller Option). Zweitens Microforge System (erbaut im Haus) wird verwendet, um die Mikropipetten auf die gewünschte Größe Öffnung geschnitten. Handelsregister Modelle Microforge Systeme sind ebenfalls verfügbar.
Um Schwingungen der Mikropipetten während des Experiments, das Mikroskop zu vermeidenopa, zusammen mit der Mikromanipulatoren, basiert auf einer Luftfederung Tisch gelegt.
Abbildung 3 Running Haftung Frequenz F i für bestimmte (A) und unspezifische (B) Bindung an 1s (rot) und 10s (blau) Kontaktzeiten von wiederholten Haftung Testzyklen zwischen RBC mit ICAM-1 (A) oder Higg beschichtet gemessen (B ) mit humanen Neutrophilen Ausdruck Integrin α L β 2. F i = (X 1 + X 2 + ... + X i) / i (1 ≤ i ≤ n), wobei i den Prüfzyklus Index, X i ist gleich "1" (Adhäsion) oder "0" (keine Haftung). F n (n = 50) wurde als beste Schätzung für die Haftung Wahrscheinlichkeit verwendet.
Abbildung 4 Kinetik derICAM-1-Bindung an neutrophilen Integrin α L β 2 ( 
). Adhesion Wahrscheinlichkeit gemessen, wie in Abbildung 3 für drei Zellpaaren an jedem Kontaktpunkt Mal gezeigt wird gemittelt und aufgetragen gegen Kontaktzeit. Die Kammer Medium wurde HBSS mit 1mM jeder Ca 2 + und Mg 2 + und 1μg/ml dimerer E-Selektin-Ig zu regulieren α L β 2-Bindung. Zur Erfassung ICAM-1-Ig auf Erythrozyten, ein Zwischenschritt wurde hinzugefügt, um Erythrozyten mit 10μg/ml Fänger-Antikörper (biotinylierter Ziege-Anti-Human-Fc-Antikörper, eBioscience) nach dem Streptavidin Inkubationsschritt inkubieren. Zur Kontrolle unspezifischer Bindung zwei verschiedenen Bedingungen wurden verwendet: 1) RBCs beschichtet mit anti-human-Fc Fänger-Antikörper inkubiert und mit humanen IgG anstelle von ICAM-1-Ig (O) und 2) Neutrophile Bindung an Erythrozyten nicht mit der beschichteten Fänger-Antikörper (Δ). 10μg/ml IgG wurde dem Medium aufgenommen zu minimieren Bindung von E-Selektin-Ig in Lösung des Capture-Antikörper auf der Oberfläche RBC. Die unspezifische Bindung als menschliche IgG Regelkurve aufgenommen wurde verwendet, um eine spezifische Adhäsion Wahrscheinlichkeit Kurve zu erhalten ( 
) Mit Gl. 2. Fitting spezifische Adhäsion Wahrscheinlichkeit Kurve mit Gl. 1 (durchgezogene Linie) wieder wirksam Bindungsaffinität A c K a = 1,4 • 10 -4 μm4 und k off = 0,3 s -1.
| Reagens | MW (g / mol) | Konzentration (mM) | Menge (g) |
|---|---|---|---|
| Adenin | 135,13 | 2 | 0,27 |
| D-Glucose (Dextrose) | 180,16 | 110 | 19,82 |
| D-Mannitol | 182,17 | 55 | 10,02 |
| Natriumchlorid (NaCl) | 58,44 | 50 | 2,92 |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na HPO ) | 141,95 | 20 | 2,84 |
| L-Glutamin | 146,15 | 10 | 1,46 |
Tabelle 1. EAS-45-Puffer Vorbereitung (1L).
| 25 mg Biotin-XHS in 550 ul DMF | 0,1 M Biotin-Lösung |
| 1:10 Verdünnung von 0,1 Biotin w / DMF | 0,01 M Biotin-Lösung |
| 1:100 Verdünnung von 0,1 Biotin w / DMF | 0,001 Biotin-Lösung |
Tabelle 2. Vorbereitung der Biotin-Lösung.
| Biotin Endkonzentration (M) | 4 | 10 | 20 | 50 | 100 | 160 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| RBCs Pellet Lager (ul) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1x PBS (ul) | 179,2 | 178 | 176 | 179 | 178 | 176,8 |
| 0,1 M Boratpuffer (ul) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 0,01 M Biotin-Lösung (ul) | 1 | 2 | 3,2 | |||
| 0,001 Biotin-Lösung (ul) | 0,8 | 2 | 4 |
Tabelle 3. Biotinylierung von RBC.
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Discussion
Um erfolgreich mit der Mikropipette Haftung Frequenz Assay man mehrere kritische Schritte in Betracht ziehen sollten. Stellen Sie zunächst sicher, um die spezifische Wechselwirkung für die Rezeptor-Ligand-System von Interesse aufnehmen. Unspezifische Kontrollmessungen (vgl. Abb.. 3, 4) gewährleisten die Spezifität. Idealerweise sollten unspezifische Adhäsion Wahrscheinlichkeiten unter 0,05 für jeden Kontakt Zeitdauern zu sein und einen signifikanten Unterschied zwischen der spezifischen und unspezifischen Haftung Wahrscheinlichkeiten für jeden Zeitpunkt haben. Verschiedene Methoden können zur Kopplung der Liganden an die roten Blutkörperchen Oberfläche. Es wurde gezeigt, dass Chromchlorid Kopplung Methode 17 ein höheres Niveau der unspezifischen Bindung als Biotin-Streptavidin-Kopplung gab.
Zweitens sollte eine Haftung Wahrscheinlichkeit für spezifische Wechselwirkung in der Mitte liegen. Diese Anforderung kann durch Variation der Dichte der Rezeptoren und Liganden (oder nur Liganden auf Erythrozyten, wenn Rezeptoren konstitutiv auf exprimiert erfüllt sinds die Dichte, die schwer zu ändern ist). Zu diesem Zweck beim Testen eines neuen Systems mit unbekannten Rezeptor-Ligand-Bindungsaffinität, bereiten eine Reihe von biotinylierten Erythrozyten (siehe Tabelle III als Beispiel) zu einer Vielzahl von Liganden Dichten zu testen. Die steady-state Haftung Wahrscheinlichkeit sollte nicht mehr als 0,8 im Durchschnitt, wie sein Zell-Zell-Rezeptor-Dichte Variation in der Regel bringt die Klebkraft von einigen Zellen auf 1, wenn die durchschnittliche Ligandendichte ist zu hoch. Bei der ersten Prüfung auf Spezifität, wenn einige Zellen haben Adhäsion Ebenen von 0 oder 1, muss der Ligandendichte angepasst werden. Unspezifische Kontrollmessungen in der Regel folgen die spezifischen Messungen und hier möchte man, um die Haftung Wahrscheinlichkeit haben so nah wie möglich bei Null.
Drittens finden Sie die richtige Auswahl für die Kontaktzeiten. Wenn der Kontakt lang genug ist, die exp (- k off t) in Gl. 1 geht auf Null und die effektive 2D-Affinität kann vom Plateau berechnet werdender Haftung Kurve 1: 
Die off-Rate k off bestimmt die Übergangsphase oder wie schnell die Haftung Kurve erreicht ein Plateau Ebene. Zur Abschätzung der off-Rate exakt erfordert Messungen von verschiedenen Punkten auf einem Plateau-Ebene sowie genügend Zeit Punkte in der Übergangsphase. Accounting für die drei entscheidenden Schritte oben beschriebene wird erhalten Bindungskurven ähnlich Abb.. 4.
Die verbleibende Aufgabe ist es, eine Rezeptor-Ligand-Bindung Kinetik-Modell verwenden, um die experimentell gemessenen Bindung Kurve zu interpretieren und von 2D-kinetischen Parameter aus Anpassung des Modells Vorhersagen zu den Daten zu schätzen. Anzumerken ist, dass Gl. 1 stellt eine einfachste Modell zweiter Ordnung nach vorne, erster Ordnung umzukehren, Single-Step, reversible Kinetik zwischen einem einzelnen Rezeptor-Ligand-Spezies 1. Mehr komplexe kinetische Prozesse sind beschrieben worden, darunter the Fälle von Dual-Rezeptor-Liganden-Arten 3,4, zweistufige Bindung ohne 14 oder mit 19 trimolekulare Interaktionen und Haftung Kinetik durch aktive Zentrum Bildung statt Bindung Kinetik 10 begrenzt. In diesen Fällen sind komplizierter mathematischer Modelle benötigt, um die Haftung Wahrscheinlichkeit vs Kontakt Zeit-Kurve und die Rezeptor-Ligand Bindungskinetik beziehen.
Das anhaltende Interesse an der Kinetik der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung ergibt sich aus der Grundannahme, dass die Kinetik Parameter eine Rolle spielen bei der Bestimmung der nachgeschalteten Signalkaskaden innerhalb der Zelle. Die Mikropipette Haftung Frequenz-Assay hier vorgestellte ist einer der wenigen Methoden, die in situ Messungen der zweidimensionalen (2D) Bindungskinetik ermöglichen. Zweidimensionale bedeutet, dass beide Rezeptoren und Liganden auf der Zelloberfläche sind, wie natürlicherweise in vielen Zell-Zell-Wechselwirkungen innerhalb des Organismus. Die 2D-Geschwindigkeitskonstanten von Rezeptor-Ligandenund verbindliche Auskunft, wie schnell Zellen binden, um miteinander oder mit der extrazellulären Matrix, wie lange sie gebunden bleiben, und wie viele Anleihen bilden. Zum Vergleich: in der Surface Plasmon Resonance (SPR)-Methode 23 eine der wechselwirkenden Moleküle in der flüssigen Phase, also rief dreidimensionale (3D) verbindlich. Da beide interagierende Moleküle gereinigt und isoliert von der zellulären Umgebung, konnten die kinetischen Parameter in 3D-Messung erhalten werden drastisch unterscheiden sich von denen in 2D-Messungen selbst für das gleiche Rezeptor-Liganden-Paares 17 erhalten.
Die Haftung Frequenz-Methode analysiert 2D-Kinetik auf lebende Zellmembran und bietet somit eine Gelegenheit für eine auf die biophysikalischen und biochemischen Bestimmungen der zellulären Umgebung zu analysieren. Dazu gehören die Membran microtopology 5, Membrananker 2, molekulare Orientierung und Länge 6, Träger Steifigkeit 9 und curvatur 20, Impingement Kraft 20 und Modulatoren des Zytoskeletts und Membran-Organisation, wo die interagierende Moleküle befinden 15,17.
Da Cross-Junction-Rezeptor-Liganden-Interaktion erfordert direkten physischen Kontakt zwischen zwei Zellen und die Ergebnisse in physikalische Verknüpfung zwischen zwei Zellen, kann die chemische Reaktionskinetik von molekularen Wechselwirkungen durch eine mechanische Tests, dass die Zellen bringt in Kontakt und erkennt durch den Effekt Bindung analysiert werden von Gewalt. Obwohl wir exemplarisch die Haftung Frequenz-Assay mit einer Mikropipette-Saugmotor RBC als Haftvermittler Sensor kann anderen Kraft-Techniken verwendet werden, einschließlich der Rasterkraftmikroskopie 24, Biomembran Kraft Sonde 8,17, optische Pinzette 25, und der integrierte Mikropipette und Cantilever-26.
Andere mechanisch-basierte 2D-Assays entwickelt worden. Dazu gehören die Temperaturschwankungen Assay 8, centrifugaTION Assay 27,28, Rosettierung Assay 29 und Flusskammer Assay 30,31.
Die Beschränkung der Haftung Frequenz-Test ist die langsame und arbeitsintensive Art des Assays aufgrund der wiederholten serielle Zyklen mit einem einzigen Paar von Zellen getestet einen Kontakt zu einem Zeitpunkt. Schwierig wird es für die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen mit langsamen off-Raten, weil lange Kontaktzeiten für die Bindung Kurve zu erreichen steady-state erforderlich wäre, so dass das Experiment inhibitively lang.
Der Kraftaufnehmer durch eine Mikropipette-Saugmotor RBC konstruiert ist in der Lage zur Erkennung Pikonewton-Level-Kräfte, die um eine Größenordnung niedriger als die typische Stärke eines nichtkovalente Rezeptor-Ligand-Bindung 1,32 ist. Allerdings Rezeptor-Ligand-Dissoziation kann auch dann auftreten, bei Null Kräfte. Jede schwache Adhäsion, unentdeckt führt geht zu einer Unterschätzung der Bindungsaffinität und-rate 1.
TEr Haftung Frequenz-Methode geht davon aus, dass jede Haftung Test identisch und unabhängig von den anderen ist. Diese Anforderung könnte verletzt, als für einige Systeme 33, wo derzeit Haftung erhöht oder verringert die Wahrscheinlichkeit des nächsten Haftung gezeigt wurde. Die Matlab-Code für die Überprüfung, ob die Voraussetzung für die aufgenommene Sequenz der Haftung Ereignisse erfüllt ist auf Anfrage erhältlich.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom NIH gewährt R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 und R01GM096187 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD Biosciences | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport Corp. | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piez–lectric translator | Physik Instruments | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetic Systems | 5200 Series | Micropipette system |
References
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