Summary
Un test per la misurazione della frequenza adesione recettore-ligando cinetiche di interazione quando entrambe le molecole sono ancorate sulla superficie delle cellule interagiscono è descritto. Questo test meccanico-based è esemplificato con una micropipetta pressurizzato globulo rosso umano come sensore di adesione e integrina αLβ2 e molecola di adesione intercellulare-1 come interagire recettori e ligandi.
Abstract
Il test di adesione micropipetta è stato sviluppato nel 1998 per misurare bidimensionali (2D), recettore-ligando cinetica di legame 1. Il test utilizza un globulo rosso umano (RBC) come sensore di adesione e delle cellule che si presentano per una delle molecole interagenti. Impiega micromanipolazione per portare il RBC in contatto con un'altra cellula che esprime l'altra molecola che interagisce con zona controllata con precisione e tempo per consentire la formazione di legame. L'evento viene rilevato come l'adesione allungamento RBC su tirando le due celle di distanza. Controllando la densità dei ligandi immobilizzato sulla superficie dei globuli rossi, la probabilità di adesione è tenuto in mid-range compreso tra 0 e 1. La probabilità di adesione è stimata dalla frequenza di eventi adesione in una sequenza di cicli ripetuti contatti tra le due cellule per un dato tempo di contatto. Variando il tempo di contatto genera una curva vincolante. Montaggio di un modello probabilistico per recettore-ligando cinetica di reazione 1 al legamecurva restituisce l'affinità 2D e off-rate.
Il test è stato validato mediante interazioni dei recettori Fcy con IgG Fc 1-6, selectine con leganti glicoconiugato 6-9, integrine con leganti 10-13, homotypical vincolante caderina 14, recettore delle cellule T e corecettore con peptide-grandi complessi di istocompatibilità 15 - 19.
Il metodo è stato utilizzato per quantificare regolamenti della cinetica 2D da fattori biofisici, come ad esempio la membrana microtopology 5, della membrana di ancoraggio 2, orientamento molecolare e lunghezza 6, rigidità vettore 9, curvatura 20, e la forza impingement 20, così come i fattori biochimici, come modulatori del microambiente citoscheletro e membrana in cui le molecole interagiscono risiedono e l'organizzazione della superficie di queste molecole 15,17,19.
Il metodo è stato utilizzato anche to studiare il legame simultaneo di doppio recettore-ligando specie 3,4, e le interazioni trimolecular 19 con un modello modificato 21.
Il principale vantaggio del metodo è che permette lo studio dei recettori di membrana nel loro ambiente nativo. I risultati potrebbero essere molto diversi da quelli ottenuti con recettori purificati 17. Consente inoltre lo studio del recettore-ligando interazioni in un lasso di tempo inferiori al secondo con risoluzione temporale ben oltre i tipici metodi biochimici.
Per illustrare l'adesione metodo micropipetta frequenza, ci mostrano la misurazione cinetica della molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) funzionalizzati su globuli rossi legame β integrina α L 2 sui neutrofili con dimerica E-selectina nella soluzione per attivare α β L 2.
Protocol
1. Isolamento globuli rossi del sangue intero
- Preparare EAS-45 soluzioni. Pesare tutti gli ingredienti dalla tabella I e sciogliere in 100-200ml di acqua deionizzata. Aggiungere acqua per rendere la soluzione 1000ml e aggiustare il pH a 8,0. Filtro e aliquota da 50ml. Congelare a -20 ° C per la conservazione.
Nota: Passo 1,2 dovrebbe essere eseguita da un medico addestrato ad esempio come infermiera, con un Institutional Review Board protocollo approvato.
- Disegna 3-5ml di sangue dalla vena cubitale mediana in una provetta da 10 ml contenente EDTA e delicatamente mescolare il sangue con EDTA immediatamente e accuratamente per evitare la coagulazione.
- Processo di campione di sangue appena possibile. Tutti i passi seguenti, tranne centrifugazione deve essere effettuato sotto il cofano per mantenere la preparazione sterile. Trasferire il sangue in una provetta da centrifuga da 50 ml, aggiungere 10 ml di HISTOPAQUE freddo e sterile 1077 e centrifugare per 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Ripetere due volte.
- Aggiungere 10ml freddo e sterile PBS, centrifugare per 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Ripetere 4 volte (totale di 5 volte).
- Lavare con sterili EAS-45 (5min @ 1000rpm, 4 ° C) due volte. Negli ultimi globuli rossi spostare il lavaggio in una nuova provetta sterile 15ml.
- Risospendere globuli rossi EAS-45 in10ml.
2. RBC biotinilazione
- Prendete il tubo con globuli rossi dal punto 1. Rimuovere tutti i surnatante dopo centrifugazione per 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Mettere 10μl di GR pellet a ciascuno di fiale diverse e aggiungere corrispondente quantità di soluzione salina in ogni flaconcino (vedere tabella II, ad esempio di preparazione di sei differenti concentrazioni biotinilazione globuli rossi).
- Fai fresca Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 diluizioni secondo la Tabella II.
- Aggiungere 10μl di tampone borato 0.1M a ogni flacone.
- Aggiungi quantità calcolata di biotina soluzione ad ogni flacone (vedi Tabella II come esempio) e vortice immediatamente.
- Luogo ogni flacone RBCall'interno di un tubo da 50 ml conica e incubare in rotatori per 30 min a temperatura ambiente.
- Lavare ogni flaconcino 3 volte con 800μl di EAS-45 per 2min @ 2000rpm.
- Aggiungere 100μl di EAS-45 per ogni flacone e conservare a 4 ° C. In ogni 1ml della soluzione finale, ora dovrebbe essere ~ 1mln di globuli rossi.
3. Funzionalizzazione della biotina-linked * ligandi su globuli rossi
- Preparare 2mg/ml soluzione streptavidina secondo le istruzioni del produttore. Soluzione Aliqouted possono essere conservati a -20 ° C.
- Mescolare una pari quantità di globuli rossi a partire dal punto 2.7 (10μl) con la soluzione streptavidina, vortice immediatamente e incubare in rotatori per 30min a 4 ° C.
- Lavare 3 volte con 500μl di EAS-45 per 2min @ 2000rpm. Aggiungi EAS-45 15μl / 1% BSA per la conservazione.
- Mix pari quantità di globuli rossi a partire dal punto 3.3 (10μl) con la soluzione legante 20μg/ml, vortice immediatamente e incubare in rotatori per 30 min a temperatura ambiente.
- Lavare due volte con 500μl di EAS-45 / 1% di BSA per 2min @ 2000rpm. Aggiungere 15μl di EAS-45 / 1% di BSA per la conservazione.
* Se la vostra proteina non ha alcun legame biotina è possibile utilizzare uno dei kit disponibili in commercio per biotinilazione proteine (per esempio, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-biotinilazione Kit) o utilizzare biotinilato anticorpi di cattura come un passo intermedio, come mostrato nel video.
4. Quantificazione delle densità del recettore e ligando
- Incubare ligando rivestite globuli rossi dal punto 3 e, in un altro flacone, recettore-cuscinetto cellule con concentrazioni di anticorpi monoclonali rispettivi saturando per 30 min a temperatura ambiente. Incubare a separare le cellule flaconcini con irrilevanti isotipo-abbinato anticorpi per il controllo. Se gli anticorpi primari non sono fluorescente, incubare con anticorpi secondari coniugati con fluorescenza in base alle istruzioni del produttore.
- Analizzare i campioni preparati al punto 4.1 per cytometery flusso con corrispondente fluorescenti calcalibrazione di perline. Calcolare la densità come mostrato in fig. 1.
5. Preparazione per micropipetta e della camera di cellulari
- Tirare micropipette da tubi capillari utilizzando PN-30 Magnetic Narishige 'Puller microelettrodo orizzontale di vetro o Sutter Instruments Micropipetta Puller.
- Usa micromanipolatore con microforge per regolare la punta della micropipetta tirato ad una dimensione desiderata (di solito gli intervalli di diametro richiesto dal 1-5 micron a seconda delle dimensioni delle cellule da utilizzare nello studio).
- Preparare la camera cellula tagliando copertura in vetro Microscopio alle dimensioni desiderate. Tenuta la camera con l'olio minerale da entrambi i lati per evitare l'evaporazione medio di cambiare l'osmolarità durante l'esperimento.
- Aggiungere le cellule recettore e ligando-cuscinetto alla camera.
6. Micropipetta adesione saggio di frequenza
- Aspirare le cellule interagiscono con pipette rispettivi e uso del computer programmati piezoelectr traduttore ic a guidare l'RBC dentro e fuori del contatto con la cellula altro con superficie di contatto controllata e tempo. Rilevare eventi adesione osservando allungamento RBC sulla separazione delle cellule.
- Ripetere il contatto-ritiro ciclo 50-100 volte per un dato tempo di contatto. Registrare gli eventi osservati adesione con l'aggiunta di "1" per l'adesione o "0" per l'adesione in una colonna del foglio di calcolo Excel. È possibile utilizzare un dispositivo di registrazione, ad esempio, media digitali o videocassetta, per le immagini microscopiche.
- Registrare la frequenza di adesione in funzione del tempo di contatto della curva utilizzando almeno tre coppie di cellule diverse per ogni tempo di contatto per ottenere una media e SEM.
- Registrare la curva non specifico per il controllo tramite globuli rossi rivestiti con leganti irrilevanti (ad esempio BSA) e / o il blocco dei ligandi o recettori utilizzando i loro anticorpi monoclonali specifici blocco funzionale. Frequenza di adesione specifiche in ogni punto il tempo di contatto può essere calcolato con la rimozione della frequenza di adesione aspecifica 1.
- Montare la frequenza specifica adesione P uno contro dati di contatto tempo t da un modello probabilistico (Equazione 1) che descrive un secondo ordine in avanti e di primo ordine inverso in un unico passaggio interazione tra una singola specie di recettori e una singola specie di ligandi 1 :
dove K a è la 2D affinità efficacia vincolante, k fuori è la off-rate, m r e m l sono rispettivamente il recettore e ligando densità misurata al punto 4, e A c è l'area di contatto. La curva-fit ha due parametri, A c K a e k off, come A c e K a sono ammassati insieme e chiamato collettivamente come efficace affinità 2D. Il suo prodotto con la bassa velocità è l'effettivo 2D-rate: una c = k su A c K una k x off.
La specifica adesione frequenza P a è calcolato per differenza della frazione adesione aspecifica (P aspecifico) dalla totale adesione misurata (P misurata) 1,21:
8. Rappresentante dei risultati:
Figura 1 Determinazione del β integrina α L 2 densità sito sui neutrofili. I neutrofili sono stati incubati con 1μg/ml di E-selectina-Ig per 10 minuti in modo che corrisponda alla condizione sperimentale utilizzato nelle figure 3,4 o senza E-selectina-Ig, e poi con le concentrazioni di saturazione (10μg/ml) PE-coniugato contro -CD11a umano monoclonale (clone HI111, vedi Tabella di specifichereagenti e attrezzature) o il mouse IgG1 irrilevante per il controllo, lavato, e analizzati immediatamente. I campioni sono stati continua a leggere BD citometro a flusso LSR con lo standard QuantiBRITE gocce di taratura PE. Pannello A mostra istogrammi di fluorescenza di perline di calibrazione (rosa) insieme a quelli di cellule trattate (colore blu) o non trattati E-selectina-Ig (colore verde). Specifiche CD11a colorazione mAb è mostrato in curva solida e irrilevante isotipo-matched colorazione anticorpo di controllo è mostrato in curva tratteggiata. Cellule trattate con E-selectina-Ig (presenza in tutte le fasi di lavaggio e nel tampone FACS) non ha influenzato la densità CD11a come si vede dal confronto con cellule non trattate. Pannello B mostra il processo di quantificazione densità. Log10 è stato calcolato per l'intensità media fluorescente (FI) di ogni valore di picco di istogrammi di calibrazione quattro perle dal Pannello di A (cerchi rosa) e per il lotto-specifici per molecole di PE tallone (dal produttore). Una regressione lineare di molecole Log10 PE per tallone contro Log10 fluorescriferimento è stata tracciata. Per le cellule trattate E-selectina il Log10 FI (y) i valori pari 3,99 (blu cerchio pieno) e 2.23 (blu cerchio aperto) per specifici mAb e anticorpo di controllo, respectivly. Abbiamo risolto l'equazione lineare per x (i valori sono rappresentati come cerchi verdi e blu sul pannello B) x = Log10 PE / cellulare e, come PE:. MAb rapporto era 1:1, il numero totale di β α L 2 sui neutrofili è stata calcolato come 9587. Densità superficiale è stata calcolata da 43 molecole / 2 micron, utilizzando 8.4μm come il diametro dei neutrofili 22. Densità di ICAM-1 è stata misurata analogamente da cytometery flusso utilizzando PE-anti-CD54 mAb umano, che è pari al 65 mol / micron 2.
Figura 2 Micropipetta sistema schemi. Il nostro sistema micropipetta è stato assemblato in casa e si compone di tre sottosistemi: un sottosistema di imaging per consentire di osservare, record e analizzare i movimenti della micropipetta aspirato di cellule, un sottosistema di micromanipolazione permettono di selezionare le celle dalla camera di cella, e un sottosistema di pressione permettono di aspirare le cellule in micropipette. Il pezzo centrale del sottosistema di imaging viene invertito microscopio (Olympus IMT-2 IMT2) con un 100x immersione in olio NA obiettivo 1,25. L'immagine viene inviata a un videoregistratore attraverso un dispositivo coppia carica (CCD) della fotocamera. Un timer video è abbinato al sistema per tenere traccia del tempo. Ogni micropipetta può essere manipolato da una trasmissione meccanica montata sul microscopio e finemente posizionato con un tre assi micromanipolatore idraulico. Manipolatori meccanici da Newport potrebbe essere utilizzato come bene. Uno dei titolari micropipetta è montato su un traduttore piezoelettrico, il conducente del quale è controllato da un computer di LabView codice (disponibile su richiesta) e si traduce segnale attraverso una scheda DAQ attraverso un amplificatore di tensione (in casa) per l'attuatore piezoelettrico. Questo è unllows uno per spostare la pipetta maniera precisa e ripetibile in un ciclo di test di adesione. Il sottosistema di regolazione della pressione viene utilizzato per controllare di aspirazione durante l'esperimento. Una linea idraulica collega il titolare micropipetta ad un serbatoio del liquido. Un posizionatore multa meccanico permette l'altezza del serbatoio in modo preciso manipolato.
Micropipette vengono generati utilizzando KIMAX punto di fusione tubi in vetro borosilicato capillari (con diametro esterno di 1,0 ± 0,07 mm e un diametro interno di 0,7 ± 0,07 mm. In primo luogo, il micropipette da tubi capillari sono tirati con PN-30 Magnetic Narishige 'Puller microelettrodo orizzontale di vetro (Sutter Instruments Micropipetta Puller è un'altra opzione estrattore). In secondo luogo, il sistema Microforge (costruita in casa) è usato per tagliare il micropipette di apertura dimensione desiderata. modelli commerciali di sistemi di Microforge sono disponibili pure.
Per evitare vibrazioni della micropipette durante l'esperimento, il microscOPE, insieme al micromanipolatori, è posto su un tavolo sospensioni pneumatiche.
Figura 3 Esecuzione di frequenza F adesione per i specifici (A) e aspecifici (B) vincolanti a 1s (rosso) e 10s (blu), tempi di contatto misurato da cicli ripetuti test di aderenza tra RBC rivestito con ICAM-1 (A) o Higg (B ) con neutrofili umani che esprimono integrina α β L 2. F i = (X 1 + X 2 + ... + X i) / i (1 ≤ i ≤ n), dove i è l'indice ciclo di prova, X i è uguale a "1" (adesione) o "0" (non adesione). F n (n = 50) è stata utilizzata come la migliore stima per la probabilità di adesione.
Figura 4 Cinetica diICAM-1 legame neutrofili β integrina α L 2 ( 
). Probabilità adesione misurata come indicato nella figura 3, per tre coppie di cellule in ogni tempo di contatto è media e funzione del tempo di contatto. Il mezzo è stato HBSS camera con 1 mM ciascuno di Ca 2 + e Mg 2 +, più 1μg/ml dimerica di E-selectina-Ig di upregulate β L α 2 vincolanti. Per catturare ICAM-1-Ig di globuli rossi, un passaggio intermedio è stato aggiunto al incubare globuli rossi con anticorpo di cattura 10μg/ml (biotinilato di capra anti-umano degli anticorpi Fc, eBioscience) dopo la fase di incubazione streptavidina. Per controllare per non specifico vincolante due condizioni differenti sono stati utilizzati: 1) globuli rossi rivestiti con l'anti-umano-Fc anticorpo di cattura e incubate con IgG umane invece di ICAM-1-Ig (O) e 2) neutrofili legame con i globuli rossi non rivestito con la la cattura degli anticorpi (Δ). 10μg/ml IgG è stato aggiunto al mezzo per ridurre al minimo vincolante di E-Selectina-Ig in soluzione al anticorpo di cattura sulla superficie dei globuli rossi. Legame aspecifico registrato come curva di IgG umane di controllo è stato utilizzato per ottenere una specifica curva di probabilità di adesione ( 
) Con Eq. 2. Adattamento specifico probabilità curva dell'aderenza con l'eq. 1 (linea continua) ha restituito efficace affinità di legame A c K a = 1,4 • 10 -4 μm4 e k off = 0,3 s -1.
| Reagente | MW (g / mol) | Concentrazione (mM) | Importo (g) |
|---|---|---|---|
| Adenina | 135,13 | 2 | 0,27 |
| D-glucosio (destrosio) | 180,16 | 110 | 19,82 |
| D-mannitolo | 182,17 | 55 | 10,02 |
| Cloruro di sodio (NaCl) | 58,44 | 50 | 2,92 |
| Fosfato di sodio, bibasico (Na HPO ) | 141,95 | 20 | 2,84 |
| L-glutammina | 146,15 | 10 | 1,46 |
Tabella 1. Preparazione EAS-45 buffer (1L).
| 25 mg biotina-XHS in 550 ml di DMF | 0,1 M soluzione biotina |
| Diluizione 1:10 di 0,1 biotina w / DMF | 0.01M biotina soluzione |
| Diluizione 1:100 di 0,1 biotina w / DMF | 0.001M biotina soluzione |
Tabella 2. Preparazione della soluzione di biotina.
| biotina concentrazione finale (mM) | 4 | 10 | 20 | 50 | 100 | 160 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| RBC pellet magazzino (microlitri) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1x PBS (microlitri) | 179,2 | 178 | 176 | 179 | 178 | 176,8 |
| Borato 0.1M tampone (microlitri) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 0.01M biotina soluzione (microlitri) | 1 | 2 | 3,2 | |||
| 0.001M biotina soluzione (microlitri) | 0,8 | 2 | 4 |
Tabella 3. Biotinilazione di globuli rossi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Per utilizzare con successo l'adesione saggio micropipetta frequenza si dovrebbe considerare diversi passaggi critici. Per prima cosa, assicurarsi di registrare l'interazione specifica per il recettore-ligando sistema di interesse. Misure di controllo non specifici (cfr. fig. 3, 4) garantire la specificità. Idealmente, le probabilità di adesione non specifica deve essere inferiore a 0,05 per durate di tempo tutti i contatti e di avere una significativa differenza tra le probabilità di adesione specifici e non specifici per ogni punto del tempo. Diversi metodi potrebbero essere utilizzati per accoppiare i ligandi alla superficie globuli rossi. E 'stato dimostrato che il cloruro di cromo metodo di accoppiamento 17 ha dato un maggiore livello di legame aspecifico di biotina-streptavidina accoppiamento.
In secondo luogo, una probabilità di adesione per l'interazione specifica dovrebbe essere nella gamma media. Questo obbligo può essere adempiuto variando la densità dei recettori e ligandi (o ligandi solo su globuli rossi se recettori sono espressi costitutivamente in cellules la densità che è difficile da cambiare). A tal fine, quando si verifica un nuovo sistema con sconosciute recettore-ligando affinità di legame, preparare una serie di RBC biotinilato (vedi Tabella III come esempio) per testare una varietà di densità di ligando. Allo steady-state probabilità di adesione non deve essere superiore a 0,8 in media come cellula-cellula recettore variazione di densità di solito porta il livello di adesione di alcune cellule a 1 se la densità ligando media è troppo alta. Durante il test iniziale per la specificità, se alcune cellule hanno livelli di adesione di 0 o 1, la densità ligando deve essere regolata. Misure di controllo non specifico di solito seguono le misure specifiche e qui si vorrebbe avere probabilità di adesione il più vicino possibile allo zero.
In terzo luogo, trovare l'intervallo corretto per i tempi di contatto. Se il tempo di contatto è abbastanza lungo l'exp (- k off t) termine Eq. 1 va a zero e l'affinità efficace 2D può essere calcolata dal livello plateaudella curva di adesione 1: 
Il tasso di off-k determina la fase di transizione o la rapidità con la curva dell'aderenza raggiunge un livello di plateau. Per stimare il tasso di off-richiede misure di precisione diversi punti ad un livello di plateau e punti abbastanza tempo nella fase di transizione. Contabilità per le tre fasi critiche di cui sopra uno otterrà curve legame simile a fig. 4.
Il compito restante è quello di utilizzare un recettore-ligando modello di associazione cinetica di interpretare la curva misurata sperimentalmente vincolanti e per la stima dei parametri cinetici 2D dal raccordo la predizione del modello ai dati. Va notato che la Eq. 1 rappresenta un semplice modello di secondo ordine in avanti, di primo ordine inverso in un unico passaggio, cinetica reversibili tra un singolo recettore-ligando specie 1. Processi cinetici più complessi sono stati descritti, compresi °casi e di doppio recettore-ligando specie 3,4, a due stadi vincolanti senza 14 o con 19 interazioni trimolecular, l'adesione e la cinetica limitata dalla formazione del sito attivo al posto del legame cinetica 10. In questi casi, i modelli matematici più coinvolti sono tenuti a raccontare la probabilità di adesione in funzione del tempo la curva di contatto e il recettore-ligando cinetica vincolanti.
L'interesse costante nella cinetica di interazione recettore-ligando deriva dall'ipotesi fondamentale che i parametri di cinetica hanno un ruolo nel determinare gli eventi a valle di segnalazione all'interno della cellula. Il test di adesione micropipetta frequenza qui presentato è uno dei metodi che permettono pochissime misure in situ delle due dimensioni (2D) cinetica di legame. Bidimensionale significa che entrambi i recettori e ligandi sono sulla superficie delle cellule, come naturalmente avviene in molte interazioni cellula-cellula all'interno dell'organismo. Le costanti 2D velocità cinetiche del recettore-lige vincolante fornire informazioni per quanto rapidamente le cellule si legano gli uni agli altri o alla matrice extracellulare, quanto tempo resta vincolato, e quanti legami si formerà. In confronto, nel Surface Plasmon Resonance (SPR) Metodo 23 una delle molecole che interagiscono sia in fase fluida, quindi chiamato tridimensionale (3D) vincolanti. Poiché entrambe le molecole che interagiscono sono purificati ed isolati dall'ambiente cellulare, i parametri cinetici ottenuti nella misurazione 3D potrebbe essere drasticamente diversi da quelli ottenuti nelle misurazioni 2D anche per lo stesso recettore-ligando coppia 17.
Il metodo di analisi di frequenza adesione cinetica 2D a vivere membrana cellulare e fornisce quindi l'occasione per uno di analizzare la normativa biofisiche e biochimiche dell'ambiente cellulare. Questi includono la membrana microtopology 5, ancora membrana 2, orientamento molecolare e lunghezza 6, 9 e rigidità vettore curvatura 20, forza impingement 20, e modulatori del citoscheletro e di organizzazione della membrana in cui le molecole interagiscono risiedono 15,17.
Perché cross-giunzionale recettore-ligando interazione richiede il contatto fisico diretto tra due cellule e dei risultati in collegamento fisico tra due cellule, la cinetica di reazione chimica di interazione molecolare può essere analizzato da un saggio meccanico che mette in contatto le cellule e rileva vincolante per l'effetto della forza. Anche se abbiamo esemplificato il saggio di frequenza adesione utilizzando una micropipetta-aspirato RBC come un sensore di adesione, le tecniche di altra forza può essere utilizzata, tra cui la microscopia a forza atomica 24, biomembrane forza sonda 8,17, pinzette ottiche 25, e la micropipetta integrato e cantilever 26.
Altri test meccanicamente basata 2D sono stati sviluppati. Questi includono l'analisi termica fluttuazione 8, centrifugazionezione saggio 27,28, rosette saggio 29, e la camera di test del flusso 30,31.
La limitazione del dosaggio frequenza adesione è la natura lenta e alta intensità di lavoro del test a causa dei cicli ripetuti di serie con una singola coppia di cellule testato un contatto alla volta. Diventa difficile per il recettore-ligando interazioni con lenti off-tariffe perché i tempi di contatto lunghi sarebbe necessaria per la curva vincolante per raggiungere steady-state, rendendo l'esperimento inhibitively lungo.
Il trasduttore di forza costruita da una micropipetta aspirato RBC è in grado di rilevare piconewton livello di forze, che è un ordine di grandezza inferiore a quello tipico di una forza non covalenti recettore-ligando legame 1,32. Tuttavia, recettore-ligando dissociazione potrebbe verificarsi anche a zero forze. Ogni adesione debole che va porta inosservati ad una sottovalutazione del l'affinità di legame e il tasso di 1.
Tha frequenza metodo adesione presuppone che ogni test di adesione è identico e indipendente dagli altri. Tale requisito potrebbe essere violata come è stato dimostrato per alcuni sistemi 33, dove l'adesione corrente aumentata o diminuita la probabilità di adesione prossima. Il codice Matlab per verificare se il requisito è soddisfatto per la sequenza di eventi ha registrato l'adesione è disponibile su richiesta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato da sovvenzioni NIH R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 e R01GM096187.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD Biosciences | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport Corp. | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piez–lectric translator | Physik Instruments | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetic Systems | 5200 Series | Micropipette system |
References
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
- Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
- Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
- Huang, J. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
- Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
- Wu, L. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
- Waugh, R. E., Lomakina, E. B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
- Zhang, F. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
- Lomakina, E. B., Waugh, R. E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
- Chien, Y. H. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
- Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
- Wasserman, H. A. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
- Huang, J. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 Forthcoming.
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
- Jiang, N. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
- Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
- Zhu, C., Williams, T. E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
- Downey, G. P. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
- Li, P. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
- Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
- Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
- Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
- Long, M. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
- Lou, J. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
- Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
- Evans, E., Berk, D., Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
- Zarnitsyna, V. I. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).
